Développement de la cristallographie sérielle de protéine utilisant le rayonnement synchrotron

Abstract

Synchrotron radiation is one of the key factors for the tremendous success of macromolecular crystallography during the past decades. More than 90 % of all protein structures in PDB database were solved by crystallography using synchrotron radiation sources and around 95 % of them were determined from cryocooled crystals1,2. A whole data set can be collected from one flash-cooled crystal. Data-collection at cryogenic temperatures drastically reduces radiation damage effects. However, structures determined using cryo freezing techniques are limited by static nature of frozen crystals.With the recent development of X-ray free-electron laser facilities (XFELs), which are able to produce extremely intense femtosecond X-ray pulses, the era of “Diffraction before destruction” and serial femtosecond crystallography (SFX) for micro-/nano-sized crystals has begun3. In the SFX technique a protein crystal is only exposed once to the X-ray beam for tens of femtoseconds before it is completely destroyed. The data is collected from randomly oriented crystals that are exposed to the X-ray beam; only one shot per crystal is possible. In order to receive a complete data set, new data analysis techniques that are capable of dealing with large quantities of diffraction data have been developed. First experiment where serial femtosecond crystallography (SFX) approach was first carried out was performed at the Linac Coherent Light Source (LCLS, Stanford, USA) in December 2009 on photosystem I and lysozyme crystals4,5,6. At XFELs facilities crystallographers can perform room temperature structure determination of proteins almost free of radiation damage, due to the fact that femtosecond flashes of FEL is so brief, that it passes through the sample before the significant radiation damage occurs.After presenting first successful experiments with SFX technique, efforts to perform serial crystallography of micron-sized crystals at room-temperature started at synchrotron sources. First attempt to perform synchrotron room-temperature serial crystallography has been done at PETRA III at DESY in Hamburg using glass capillary based microfluidics7. This method was named synchrotron serial millisecond crystallography (SMX), where thousands of patterns are collected from individual crystals passing through the X-ray beam8. With development of room-temperature serial crystallography techniques at the synchrotrons, the exposure distributed on a large number of crystals in the sample, which helps compensating the effect of increased radiation damage at ambient temperature.Although synchrotron sources most certainly will never reach the same brightness of X-ray pulses like XFELs, they have some advantages. One of them is possibility to perform any set up due to the flexibility of the parameters of microfocus beamlines. Another advantage of SMX is that several shots per crystals are possible. Also should be mentioned that synchrotrons are more widespread all over the world, so possibility to get a beamtime at the synchrotron is much higher than at XFELs, because currently only two XFEL facilities are open for users (LCLS, USA and SACLA, Japan).The aim of this dissertation is to propose and to implement methods that will allow to collect data using the serial crystallography approach at the European synchrotron radiation facility (ESRF, Grenoble, France). This dissertation presents different techniques to perform synchrotron serial crystallography at ID13 beamline. The goal was to develop synchrotron serial crystallography based on scanning micro-diffraction to demonstrate that synchrotron sources can be used as a routine instrument to perform serial crystallography with soluble and membrane proteins. The aspects of the data collection and data processing also will be discussed.Le rayonnement synchrotron est l'un des facteurs clés du grand succès de la cristallographie macromoléculaire au cours des dernières décennies. Plus de 90% de toutes les structures de protéines de la base de données PDB a été résolu par cristallographie en utilisant des sources de rayonnement synchrotron et environ 95% d'entre elles a été déterminé à partir de cristaux congelés.Cependant, les structures déterminées par des techniques de congélation sont limitées par la nature statique des cristaux congelés. Avec le développement récent des sources de RX produites par lasers à électrons libres (XFEL), qui sont en mesure de produire des impulsions femtosecondes très intenses de rayons X, l'ère de la « diffraction avant destruction » et de la cristallographie sérielle femtoseconde utilisant des micro- ou nano- cristaux a commencé (SFX).Au cours du procédé SFX un cristal de protéine n'est exposé qu'une fois au faisceau de rayons X pendant quelques dizaines de femtosecondes avant qu'il ne soit complètement détruit. Les données sont collectées à partir de cristaux orientés de façon aléatoire par rapport au faisceau de rayons X; une seule exposition par cristal est possible. Afin de recevoir un ensemble de données plus complet, de nouvelles techniques d'analyse de données de diffraction ont été développées.La première expérimentation réussie du procédé (SFX) a été réalisée au LCLS à Stanford en décembre 2009 sur des cristaux du photosystème I et de lysozyme. Les experts en cristallographie des installations XFEL peuvent déterminer des structures de protéines à température ambiante presque exemptes de dégâts d'irradiation, en raison des pulses de FEL femtosecondes si brèves, qu'ils passent à travers l'échantillon avant que des dommages de rayonnement importants ne se produisent.Après la présentation des premières expériences SFX réussies, des efforts pour effectuer une cristallographie en série de cristaux de taille de l’ordre des micromètres à température ambiante ont commencé au sein des synchrotrons. Une première tentative de cristallographie synchrotron en série et à température ambiante a été tentée à PETRA III à DESY à Hambourg. Cette méthode a été nommée SMX (synchrotron serial millisecond crystallography), où des milliers d'échantillons sont collectés à partir de cristaux individuels passant par le faisceau à rayons X. Avec le développement des techniques de cristallographie série à température ambiante au sein des synchrotrons, la répartition de la dose sur un grand nombre de cristaux compense l’augmentation des dommages liés à l’irradiation à température ambiante.Bien que les sources de rayonnement synchrotron n'atteindront probablement jamais la même luminosité que les impulsions de rayons X comme dans les XFELs, elles ont un certains nombre d'avantages. L'un d'eux est la flexibilité de configuration grâce au paramétrage de lignes de faisceaux microfocus. Un autre est que plusieurs expositions par cristal sont possibles. En outre, les synchrotrons sont plus répandus dans le monde: la probabilité d'obtenir un temps d'expérimentation dans un synchrotron est plus élevée que pour une installation XFEL. En effet, maintenant deux installations XFEL sont ouvertes pour les utilisateurs .L'objectif de cette thèse est de proposer et de mettre en œuvre des méthodes qui permettront de recueillir des données en utilisant l'approche de la cristallographie série à l'installation synchrotron européen (ESRF, Grenoble, France). Cette thèse présente différentes techniques pour réaliser la cristallographie sérielle sur la ligne ID13 à l’ESRF. L'objectif était de développer la cristallographie sérielle sur synchrotron basée sur la numérisation micro-diffraction pour démontrer que les sources de rayonnement synchrotron peuvent être utilisées comme un instrument de routine pour cette technique avec des protéines globulaires et membranaires. Les aspects de la collecte de données et leur traitement seront également discutés