Production, fonction et localisation d'Orchestine: calciprotéine spécifique de la matrice organique des structures minéralisées élaborées par le crustacé terrestre Orchestia cavimana

Abstract

Rapporteurs: Pr. Jean-Louis SAFFAR, Université Paris V ; Dr. Jean-Yves SIRE DR CNRS - Paris VII ; Examinateurs: Dr. Jean DELACHAMBRE, DR CNRS - Dijon ; Dr. Frédéric MARIN, IsoTis - Bilthoven (Pays-Bas) ; Pr. Alain PUGIN, Université de Bourgogne ; Directeur de thèse: Dr. Gilles LUQUET, Université de BourgogneAs most Crustaceans, Orchestia cavimana possesses a mineralized exoskeleton which is periodically replaced. Because of the terrestrial behaviours of this animal, this molting cycle is related to calcium storage and resorption processes. Calcium storage occurs, as calcareous concretions, in diverticula of the midgut called posterior cæca. Calcareous concretions are essentially composed of amorphous calcium carbonate precipitated within a proteinaceous organic matrix composed of a soluble fraction and an insoluble one in an EDTA-buffer. Among the soluble components of the organic matrix, a previous study led to characterize a polypeptide of 23 kDa in SDS-PAGE called Orchestin. This protein, whose gene has been cloned and sequenced, is unglycosylated and binds calcium. The aim of this work was to further characterize this protein marker. The results obtained demonstrated that Orchestin is phophorylated on serine and threonine residues. In order to study the relation between these phosphorylations and the calcium-binding ability of this protein, we produced a recombinant protein devoid of post-translational modification. The comparison of the calcium-binding ability of the native, dephosphorylated (by specific phosphatases) and recombinant proteins led us to show that phosphorylations on the serine residues are of great importance in this ability. Moreover, Orchestin interacts with calcite crystal growth in an in vitro precipitation experiment. On the other hand, the recombinant protein permitted us to explain the discrepancy of molecular masses observed between the native (23 kDa) and sequence deduced (12,4 kDa) proteins. We could thus conclude to the correspondence between the gene orchestin and the protein Orchestin. Finally the recombinant protein was used to produce antibodies in order to locate Orchestin in the biomineralized structures elaborated by O. cavimana during its molting cycle. Orchestin is not only located in the non-mineralized layers of the calcareous concretions (storage structures) but also in the same layers of the calcified spherules (mineralized structures elaborated after ecdysis to resorb the stored calcium). The physical-chemical features exhibited by Orchestin strongly suggest that this calcium-binding phosphoprotein is a key-molecule in the formation of the storage and reabsorption mineralized structures cyclically elaborated by O. cavimana.Comme la plupart des Crustacés, Orchestia cavimana possède un exosquelette minéralisé qu'il renouvelle cycliquement. Du fait des mœurs terrestres de cet animal, ces cycles de mue sont associés à des processus de stockage et de résorption de calcium. Le stockage a lieu sous forme de concrétions calcaires au niveau de diverticules de l'intestin moyen appelés cæcums postérieurs. Les concrétions calcaires sont essentiellement constituées de carbonate de calcium amorphe précipité au sein d'une matrice organique comprenant une fraction protéique soluble et une autre insoluble dans un tampon contenant de l'EDTA. Des résultats précédents ont permis de mettre en évidence, parmi les constituants de la fraction soluble, une protéine acide de masse apparente en SDS-PAGE de 23 kDa qui a été appelée Orchestine. Cette protéine, dont le gène a été cloné et séquencé, n'est pas glycosylée et fixe le calcium. Le but de ce travail a été de poursuivre la caractérisation de ce marqueur protéique. Pour ce faire, nous avons montré qu'Orchestine est phosphorylée sur des résidus sérine et tyrosine. Afin d'étudier les relations entre ces phosphorylations et l'aptitude de la protéine à fixer le calcium, nous avons produit une protéine recombinante dépourvue de toute modification post-traductionnelle. La comparaison de l'aptitude à fixer le calcium des protéines native, native déphosphorylée par diverses phosphatases spécifiques, et recombinante nous a permis de conclure à l'importance fondamentale des sérines dans cette aptitude. De plus, Orchestine interfère dans la croissance in vitro de cristaux de carbonate de calcium. D'autre part, la protéine recombinante nous a permis de lever l'ambiguïté de la divergence de masse moléculaire de la protéine observée en SDS-PAGE (de 23 kDa) et de celle déduite de la séquence (de 12,4 kDa) et de conclure à la correspondance gène orchestine-protéine Orchestine. Enfin la protéine recombinante a été utilisée pour la production d'un anticorps polyclonal afin de localiser Orchestine dans les structures biominéralisées élaborées par O. cavimana lors de son cycle de mue. Orchestine semble non seulement localisée dans les couches non minéralisées des concrétions calcaires (structures de réserve du calcium) mais aussi dans celles des sphérules calciques (structures permettant la remobilisation du calcium). Les propriétés ainsi mises en évidence nous conduisent à envisager qu'Orchestine est une molécule-clé dans la formation des structures de stockage et déstockage élaborées de manière cyclique par O. cavimana