Isolement, caractérisation et cibles de nouveaux Inhibiteurs de protéases pour la création de plantes transgéniques résistantes aux pucerons

Abstract

Jury : Michel BREHELIN Philippe BULET Philippe GIORDANENGO Lise JOUANIN Thierry LANGIN Yvan RAHBEAmong the phytophagous insects, aphids show the particularity of feeding on sap. Their stylets allow them to reach the phloem tissues, a compartment which protein/amino acid ration is low. In this context, aphids are considered to be devoid of the enzymatic stock capable of hydrolysing protein. Strategies using proteinase inhibitor (PI) as entomotoxic polypeptide are considered at first inadequate to fight this kind of insects. Nevertheless, several PI have paradox toxicity against aphids. This study is aimed at increasing the number of potential novel PI, at understanding their function in order to introduce them in biologic fight program.During this work, new informations on digestive proteolysis in Homoptera were gained: cystein proteinase cathepsins (lysosomal enzyme) are specifically expressed in gut and in a specialized organ, the bacteriocyte. They are potential targets of cystein-PI. Seedrapes expressing Oryzacystatine (isolated from rice seed) induce a 25% reduction of Myzus persicea fecundity. This result shows the possibility to express PI in phloem to fight aphids.Improvement of a serine-PI (isolated from pea) via directed mutagenesis was performed but no active form was obtained neither in Pichia pastoris nor in Arabidosis thaliana expression system. We tried to enlarge the gene pool to fight aphids. Isolation of a new cystein-PI from aphid haemolymph was initiated at the molecular and biochemical level. These results show that PI constitute a new strategy to fight aphids.Parmi les insectes phytophages, les pucerons sont particuliers car ils se nourrissent de sève élaborée. Leurs pièces buccales leur permettant d'effectuer des piqûres dans la plante et d'atteindre les faisceaux du phloème, un compartiment dont le ratio protéines/acides aminés est très déséquilibré. C'est pourquoi, dans ce contexte, les pucerons sont réputés comme ne possédant pas l'arsenal enzymatique permettant une bonne utilisation des protéines. Aussi les stratégies utilisant les inhibiteurs de protéases (IP) comme polypeptide entomotoxique ne semblent pas adaptées a priori à ce groupe d'insectes. Or plusieurs IP ont montré des toxicités paradoxales contre les pucerons.Cette étude a pour objectif d'accroître la disponibilité des gènes d'IP originaux et d'en comprendre le mode d'action afin d'en maîtriser l'introduction raisonnée dans les programmes de lutte variétale. Au cours de ce travail de thèse, des informations sur la protéolyse digestive des Homoptères ont été apportées : des protéases à cystéine, les cathepsines (enzymes lysosomiales) sont spécifiquement exprimées dans le tube digestif et dans un organe spécialisé, le bactériocyte. Elles sont la cible potentielle d'inhibiteurs de protéases à cystéine. Lorsque l'Oryzacystatine (inhibiteur de protéase à cystéine, isolé du grain de riz) est exprimé dans le colza, la fécondité du puceron Mysus persicae diminue de 25%. Ce résultat démontre qu'il est donc possible d'exprimer des IP dans le phloème pour lutter contre les pucerons. L'amélioration, par mutagenèse dirigée, d'un inhibiteur de protéases à sérine, isolé du pois, a aussi été effectuée mais son expression hétérologue dans Pichia pastoris ou Arabidospsis thaliana n'a pas permis d'obtenir une forme active. Nous avons cherché à élargir le pool de gènes disponible pour lutter contre les pucerons. L'isolement d'un inhibiteur de protéases à cystéine de l'hémolymphe du puceron a été entrepris au niveau moléculaire et biochimique. Ces résultats démontrent que les IP constituent une nouvelle voie pour lutter contre les pucerons