aequorine bioluminescence response to calcium in vitro and in cerebral cortex

Abstract

During my PhD, I investigated in vitro the calcium-dependent bioluminescence of thephotoprotein aequorin and then used its bioluminescence to image neuronal activities in theneocortical network. This genetically encoded calcium sensor can be expressed in specific cell types and its bioluminescence is not toxic and exhibit a high signal/noise ratio.I first search for mutations modifying aequorin bioluminescence, using a randommutagenesis and in vitro evolution approach. I isolated mutants showing modified stability,calcium sensitivity and/or luminescence kinetics. The study of these mutants disclosedrelationships between bioluminescence kinetics and calcium sensitivity of aequorin. These results help to understand how calcium binding leads to photon emission by aequorin.Next, I used the bioluminescence of a GFP-aequorin chimera expressed inneocortical slices with the recombinant Sindbis virus to image the activities of neuronalensembles. Using this approach, I studied the cholinergic modulation of neocortical responses to electrical stimulation. I showed that muscarinic agonists increase spatial extent and the duration of neocortical network responses to electrical stimulationsMon travail de doctorat a consisté à étudier in vitro la bioluminescence calciumdépendante de la photoprotéine aequorine puis d'utiliser cette bioluminescence afin deréaliser l'imagerie des activités du réseau néocortical. En effet, cette protéine peut êtreexprimée dans des types cellulaires spécifiques et sa bioluminescence présente un rapportsignal/bruit très élevé et pas de toxicité.Dans un premier temps, j'ai recherché des mutations modifiant les propriétés debioluminescence de l'aequorine par une approche de mutagenèse aléatoire et d'évolution in vitroJ'ai ainsi obtenu des mutants dont la stabilité, la sensibilité calcique et/ou la cinétique debioluminescence étaient modifiées. L'étude de ces mutants a permis de mettre en évidence les relations étroites entre la cinétique d'émission de la bioluminescence et lasensibilité calcique de l'aequorine. Ces travaux ont permis de mieux comprendre comment laliaison du calcium induit l'émission d'un photon par l'aequorine.Dans un second temps, j'ai développé une approche d'imagerie des activitésd'ensembles neuronaux grâce à une chimère GFP-aequorine exprimée en tranches denéocortex à l'aide d'un virus Sindbis recombinant. J'ai utilisé cette approche pour étudier lamodulation cholinergique de l'activité corticale évoquée par stimulation électrique. J'ai pumontrer que les agonistes muscariniques augmentent l'extension spatiale et la durée desréponses du réseau néocortical aux stimulations électriques