Etude comparative de couples ARNt/aminoacyl-ARNt synthétases chez la levure et la mitochondrie humaine.

Abstract

soutenue le 18 novembre 2005.My work has focused on the specific recognition of transfer RNAs (tRNAs) by aminoacyl-tRNA synthetases (aaRSs), an obligate prerequisite for translation fidelity. I have taken advantage of molecular biology strategies, based on in vitro transcribed tRNAs and cloned enzymes, to explore the structure/function relationships of yeast and human mitochondrial (mt) aminoacylation systems using large mutagenic analyses. Structural and functional aspects were further tackled by crystallization assays and in vivo approaches, respectively.So far, it was believed that recognition and aminoacylation rules of isoacceptor tRNAs from a given organism are identical. Investigation of the family of arginine isoaccepting tRNAs in yeast and its peculiar relationship with tRNAAsp lead me to the followingdiscoveries: (i) isoacceptors are aminoacylated with different efficiencies (~20 fold range) and are protected from mischarging by idiosyncratic antideterminants, (ii) isoacceptor tRNA4Arg is a remnant aspartate acceptor since only two point mutations were sufficient to convert its specificity - this is a direct example of genesis of molecular diversity from a common ancestor. Aminoacylation systems of mammalian mitochondria remain under-explored despite their tRNAs, coded by mt genome, are structurally "bizarre" and involved in severe disorders.Our efforts lead to the assignment of 10 missing nuclear genes coding for human mt aaRSs, which turned out to be encoded by a different set of genes than the one for cytosolic aaRSs.Detailed analysis of the aspartylation system, chosen as a model mt system, revealed (i) less stringent identity of a mt tRNA than of classical tRNAs, (ii) a subtle and focused adaptation of the bacterial-type nuclear-encoded mt AspRS. This illustrates co-evolutionary processes of the human mt and nuclear genomes. Further, I have uncovered the signals hindering a mttRNAAsp to be a substrate for a non-mt aaRS. Strikingly, it is not the global structural degeneracy of the tRNA which hinders the most cross-aminoacylation, but a single base-pair in the D-stem.Le travail de cette thèse s'inscrit dans le cadre de l'étude des règles qui régissent la spécificité d'aminoacylation des ARN de transfert (ARNt) par les aminoacyl-ARNt synthétases (aaRS). La précision de cette réaction est cruciale puisqu'elle détermine la fidélité de la traduction de l'information génétique et la synthèse de protéines fonctionnelles. J'ai tiré profit des stratégies de biologie moléculaire, basées sur la transcription in vitro des ARNt, la production d'enzymes clonées, et la mutagénèse, afin d'explorer les relations structure/fonction des systèmes d'aminoacylation de levure et de la mitochondrie humaine.Les aspects fonctionnels et structuraux ont été davantage explorés par des essais de cristallisation et des approches in vivo.Jusqu'à présent, il était admis que les règles de reconnaissance et d'aminoacylation d'ARNt isoaccepteurs pour un système donné devaient être identiques. L'analyse d'une famille d'ARNt isoaccepteurs de l'arginine de levure et de sa relation particulière avec l'ARNtAsp nous ont permis d'établir que : (i) les isoaccepteurs sont arginylés avec des efficacités différentes (un facteur 20 les sépare) et sont protégés de la misaminoacylation par des antidéterminants idiosyncrasiques, (ii) l'isoaccepteur ARNt4Arg possède des propriétés d'aspartylation, vestiges de son histoire évolutive, puisque seulement deux mutations sontsuffisantes pour convertir sa spécificité – c'est un exemple de génération de la diversité moléculaire par duplication de gènes. Les systèmes d'aminoacylation mt de mammifères restent peu étudiés, et ce malgré la « bizarrerie » structurale et l'implication dans despathologies sévères de leurs ARNt, codés par le génome mt. Nos efforts ont permis l'assignement des 10 gènes nucléaires manquants codant pour les aaRS mt humaines. Ceux-cisont portés par un jeu de gènes différents de celui codant pour les sysnthétases cytoplasmiques. L'analyse détaillée du système d'aspartylation, choisi comme système modèle a révélé (i) une identité de l'ARNt mt moins stringente que celle des ARNt classiques, (ii) une adaptation subtile et ciblée de l'aaRS mt, codée par le génome nucléaire et de type bactérien. Ceci illustre un processus de co-évolution entre les génomes mt et nucléairehumain. De plus, j'ai déterminé les signaux qui protègent l'ARNtAsp mt d'être un substrat des aaRS non mt. De manière surprenante, ce n'est pas la dégénérescence structurale globale del'ARNt qui empêche le plus cette aminoacylation croisée mais une simple paire de bases du bras D