Clonage par simple-hybride de facteurs de transcription régulant le gène de la tyrosine hydroxylase (TH) de rat

Abstract

Tyrosine hydroxylase is the rate limiting enzyme in catecholamine biosynthesis, a major group of neurotransmitters including dopamine, norepinephrine and epinephrine.The aim of our work was to isolate transcription factors potentially implicated in the cell-specific expression of the rat TH gene. For this purpose, we used the yeast one-hybrid system to identify proteins interacting with 2 important elements present in the TH promoter : the E box and the octameric/heptameric sequences. Three cDNA clones were obtained from 2 different cDNA libraries (whole adult rat brain and embryonic rat mesencephalon). The first cDNA corresponds to rITF2, a bHLH factor which ability to bind to the TH E box has previously been described. The second one is Lhx9, a LIM homeobox protein. Finally, the third cDNA, which we named ZENON, encodes a novel zinc finger protein showing a neuronal specific expression. These 3 factors were further characterized, revealing quite interesting features. They bind specifically to the TH promoter and are able to modulate TH gene transcription in cell lines. All 3 clones exhibit complex and changing expression patterns throughout development, however this expression is not restricted to catecholaminergic cells. To better understand the function of these factors in TH cell-specific expression, the E box and the octameric/heptameric sequences were characterized in vivo in transgenic mice. The E box plays a subtle role in peripheral catecholaminergic cells, suggesting intricate mechanisms involved in TH cell-specific expression.This work brings to light the difficulties underlying the search for transcription factors implicated in cell-specific expression mechanisms. Furthermore, our data defines a new zinc finger protein family, of which ZENON is the first member.La tyrosine hydroxylase (TH) est l'enzyme clé de la biosynthèse des catécholamines, classe fondamentale de neurotransmetteurs regroupant la dopamine, la noradrénaline et l'adrénaline. Une expression atypique des catécholamines pourrait conduire à de nombreuses complications neuropsychiatriques. L'étude des facteurs qui régulent le gène de la TH est donc déterminante.Ce travail a pour objectif l'isolement de facteurs de transcription potentiellement impliqués dans l'expression cellulaire restreinte du gène TH de rat. Dans ce but, nous avons développé une stratégie de simple-hybride dans la levure en utilisant la boîte E et les sites octamérique/heptamérique du promoteur TH comme cibles. Deux banques d'ADN complémentaire différentes ont été criblées, issues respectivement de cerveau de rat adulte et de mésencéphale embryonnaire. Ces criblages ont conduit à l'identification de 3 facteurs de transcription candidats : rITF2, un facteur bHLH ubiquitaire déjà décrit pour son aptitude à interagir avec la boîte E du promoteur TH, Lhx9, une protéine LIM à homéodomaine, et ZENON, une nouvelle protéine à doigts de zinc spécifiquement exprimée dans les neurones. La caractérisation de ces 3 facteurs a révélé des propriétés tout à fait intéressantes. Ils sont capables d'interagir spécifiquement avec le promoteur TH, et modulent la transcription du gène TH dans des lignées cellulaires. Leurs patrons d'expression sont complexes et s'inscrivent dans une dynamique développementale très particulière, mais ne sont pas spécifiques du système catécholaminergique. Pour comprendre le rôle de ces facteurs dans l'expression cellulaire restreinte de la TH, nous avons mené une étude de transgenèse des sites cibles utilisés en simple-hybride. La boîte E joue un rôle subtil dans le système catécholaminergique périphérique, illustrant la complexité des mécanismes conduisant à l'expression cellulaire restreinte de la TH. Ce travail souligne les difficultés rencontrées pour isoler des facteurs de transcription impliqués dans des processus d'expression cellulaire restreinte et définit une nouvelle famille de protéines à doigts de zinc, dont ZENON, le premier membre, semble lié au phénotype neuronal. L'identification et l'étude d'autres protéines appartenant à cette famille pourraient donc s'avérer capitales pour la compréhension des mécanismes impliqués dans la mise en place et le maintien des caractères neuronaux au cours du développement