The human RhBG protein is a member of the Rh (Rhesus) family, first characterized gas channel in mammals, and hence of the Amt/Mep/Rh superfamily of ammonium transporters. RhBG has been shown to facilitate NH3 transport and to be anchored to the basolateral plasma membrane of kidney epithelial cells, via ankyrin-G. We showed here that mutation of the ankyrin-G binding site, localized in the C-terminal cytoplasmic domain, delayed cell surface expression, decreased plasma membrane stability and abolished NH3 transport function of RhBG in epithelial cell lines. We also demonstrated that tyrosine Y429, which belongs to the YED basolateral targeting signal of RhBG, was phosphorylated in vitro using purified Src and Syk kinases. Furthermore, incubation of HEK293 cells with an inhibitor of protein-tyrosine phosphatases, pervanadate, strongly decreased transport activity of native RhBG protein but had no effect on a Y429A mutant (blocking its phosphorylation). This result shows that Y429 is the only RhBG tyrosine residue to be involved in NH3 transport regulation, through phosphorylation, and that RhBG is phosphorylated ex vivo on this tyrosine. Then, we showed that Y429D and Y429E mutations, mimicking constitutive phosphorylation, abolished NH3 transport and enhanced solubilization of RhBG from the cell membrane. In contrast, the nonphosphorylated/ nonphosphorylatable Y429A and Y429F mutants behaved the same as wild-type RhBG. Conversely, confocal microscopy studies showed that Y429A or Y429F but not Y429E or Y429D mutations of residue 429 abolished the exclusive basolateral localization of RhBG in polarized epithelial cells. All these results demonstrate that targeting, anchoring to the membrane skeleton and ammonium transport activity of RhBG are regulated by both phosphorylation and membrane skeleton binding of its C-terminal cytoplasmic domain, and lead to a model in which phosphorylation of Y429, which belongs to the YED signal, would be necessary to RhBG targeting in polarized epithelial cells, whereas dephosphorylation of this tyrosine would allow RhBG anchorage to the spectrin-based skeleton, via ankyrin-G, and activation of NH3 channel through a possible conformational change of the C-terminal domain.La protéine RhBG humaine est un membre de la famille des protéines Rh (Rhésus), premiers canaux à gaz caractérisés chez les mammifères et par conséquent, de la superfamille Amt/Mep/Rh des transporteurs d'ammonium. Elle facilite le transport de la forme neutre de l'ammonium (NH3) et est ancrée à la membrane plasmique basolatérale de cellules épithéliales rénales, via l'ankyrine G, protéine adaptatrice du squelette membranaire dépendant de la spectrine. Nous avons montré que la mutation du motif d'ancrage à l'ankyrine G, localisé dans l'extrémité C-terminale intracytoplasmique de RhBG, retarde l'adressage, diminue la stabilité à la surface et abolit la fonction de transport de NH3 de la protéine RhBG dans les cellules épithéliales HEK293. Nous avons également montré que la tyrosine Y429, qui appartient au signal d'adressage basolatéral YED de RhBG, est phosphorylée in vitro par les kinases Src et Syk purifiées. D'autre part, le traitement de cellules HEK293 par le pervanadate, un inhibiteur de phosphatases sur phosphotyrosine (donc un activateur indirect des tyrosine kinases) diminue fortement l'activité de transport de la protéine native mais pas celle d'un mutant Y429A (bloquant sa phosphorylation). Ce résultat montre d'une part que Y429 est le seul résidu tyrosine de RhBG impliqué dans la régulation du transport de NH3, via une phosphorylation, d'autre part que la protéine RhBG est phosphorylée ex vivo sur cette tyrosine. Des mutations Y429D et Y429E, mimant une phosphorylation constitutive, abolissent le transport de NH3 et favorisent la solubilisation du RhBG membranaire. À l'inverse, des mutants Y429A et Y429F non phosphorylés et non phosphorylables se comportent comme la protéine RhBG sauvage. En revanche, des études en microscopie confocale montrent que seules les mutations Y429A et Y429F entraînent une dépolarisation de l'expression de RhBG dans des cellules MDCK polarisées, les mutants Y429D et Y429E étant normalement localisés dans le domaine basolatéral des cellules. L'ensemble de ces résultats démontre que l'adressage, l'ancrage au squelette sous-membranaire et la fonction de transport d'ammonium de RhBG sont régulés à la fois par la phosphorylation et la liaison au squelette membranaire de son domaine C-terminal cytoplasmique et nous a conduit à proposer un modèle dans lequel la phosphorylation de la tyrosine Y429 faisant partie du motif YED, serait nécessaire à l'adressage de RhBG vers la membrane basolatérale de cellules épithéliales polarisées, alors que la déphosphorylation de cette tyrosine permettrait l'ancrage de la protéine au squelette membranaire, via l'ankyrine G, et l'activation du canal à NH3 par un changement conformationnel potentiel de l'extrémité C-terminale
