Ciblage de l'endothélium tumoral et inflammatoire : Recherche de ligands de la sélectine E et de l'endogline

Abstract

My work concerned tumor vasculature targeting. Compounds targeting the tumor endothelium were investigated in order to redirect drugs and induce, specifically, the destruction of the tumor endothelium and therefore the tumor. According to the literature, two targets have been identified for the present study: E selectin and endoglin. E selectin is a glycoprotein surexpressed on endothelial cells during inflammation and angiogenesis. Classically, antagonists of its natural ligand, the SleX, are researched. Based on the key interaction groups between E selectin and SleX, three mimics' families have been designed. The ability of these analogs to block the interaction of the SleX expressed on HL-60 cells with the E selectin protein was evaluated in an adhesion assay. However, none of the analogs had a sufficient affinity for a use as a targeting agent. In a second strategy, a phage library was selected on activated HUVECs to find peptide ligands of the E selectin. Some of the selected phages-peptides showed a better affinity for E selectin and / or P selectin in an ELISA assay than the insert-less phage. Their specificity for the target will soon be evaluated in competition assays with the corresponding synthetic peptides. In a second part, phage display was used to identify peptide ligands of the endoglin. First, the endoglin was cloned and expressed in mammalian cells in order to select the phage library on the cellular protein. Selection on the recombinant endoglin was also carried out to reduce the background linked to the cells. Some of the selected peptides showed sequence homologies with known endoglin ligands. The corresponding phages-peptides gave a strong signal in an ELISA assay on the recombinant protein by comparison with an insert-less peptide. Those peptides will be soon characterized. In conclusion, potential peptide ligands of E and P selectin and of endoglin were identified. This work also led us to set up the phage display technology in the laboratory and to optimize the selection procedure.Mon travail de thèse a porté sur le ciblage de la vascularisation tumorale : des molécules ciblant l'endothélium tumoral ont été recherchées dans le but d'amener des molécules thérapeutiques spécifiquement vers l'endothélium tumoral afin de le détruire et d'atteindre la tumeur qui en dépendait. D'après les données de la littérature, deux cibles ont été choisies pour notre étude : la sélectine E et l'endogline. La sélectine E est une glycoprotéine surexprimée à la surface de l'endothélium activé des zones inflammatoires et tumorales. Classiquement, des antagonistes de son ligand naturel, le SleX, sont recherchés. En nous appuyant sur les groupements clés de l'interaction entre la sélectine E et le SleX, plusieurs familles de mimes du SleX ont été élaborées. La capacité de ces mimes à déplacer l'interaction du SleX exprimé à la surface des cellules HL-60 avec la sélectine E a été évaluée dans un test d'adhésion. Cependant, aucun des mimes testés n'a présenté une affinité suffisante pour envisager son utilisation comme tête de ciblage. Une deuxième stratégie a consisté à rechercher des ligands peptidiques de la sélectine E en criblant des HUVECs activées avec une banque de peptides sur phages. Plusieurs phages-peptides testés en ELISA ont montré une meilleure affinité pour la sélectine E et / ou avec la sélectine P par rapport au phage sans insert. Des tests de compétition avec des peptides synthétiques correspondants permettront d'évaluer leur spécificité pour la cible. En ce qui concerne l'endogline, des ligands peptidiques ont été recherchés avec une banque de peptides sur phages. Dans un premier temps, le gène codant l'endogline humaine a été cloné dans un vecteur d'expression eucaryote afin de réaliser la sélection sur la protéine cellulaire. Une sélection sur la protéine recombinante a été réalisée par la suite pour diminuer le bruit de fond lié aux cellules. Parmi les peptides obtenus, certains ont montré des homologies de séquence avec des ligands de l'endogline et le test de ces phages-peptides en ELISA sur la protéine recombinante a donné un fort signal par rapport au phage sans insert. Ces peptides seront caractérisés prochainement. En conclusion, des ligands peptidiques des sélectines E et P et de l'endogline ont peut-être été identifiés. Ce travail a par ailleurs permis de mettre en place les outils nécessaires à l'utilisation de la technologie de sélection avec des banques de peptides sur phages dans les meilleures conditions possibles