Etude des relations structure/fonction d'une bactériocine anti-Listeria, la mésentéricine Y105

Abstract

Mesentericin Y105 is a sub-class IIa bacteriocin produced by Leuconostoc mesenteroides Y105. In an attempt to understand the mecanism of its anti-listerial activity, we investigated the peptides structure-function relationship. For this purpose, a bank of mesentericins Y105 peptide derivates was created with modifications at single positions of the parent peptide. Peptide derivatives were generated using, randomly primed PCR mutagenesis to create single mutations in the DNA sequences that encode the mature peptide. A method for heterologous production based on a two componant system with one vector harboring structural gene, and one other encoding the immunity protein and transport system was optimized .Thus, an universal peptide secretion tool has been established. The impact of mutations was studied for the mesentericin Y105 derivatives, by accessing there activity, secondary structure (obtained by circular dichroism in trifluoroethanol and lysophosphatidylcholin micelles), predicted tertiary structure and interaction with anisotropic environment (method of tryptophan blue shift). Finally, a nuclear magnetic resonance analysis was used to determinate the native bacteriocin structure. A general model for the mechanism of action of mesentericin Y105 and its related bacteriocins is proposed.La mésentéricine Y105 est une bactériocine de sous-classe IIa produite par Leuconostoc mesenteroides Y105. Pour comprendre le mécanisme de l'activité anti-Listeria de ce peptide et plus généralement des bactériocines de classe IIa, l'étude des relations existant entre la structure et la fonction de ce peptide a été envisagée. Dans ce but, une collection de mésentéricines Y105 modifiées au niveau d'un résidu a été produite. Afin d'obtenir ces dérivés de bactériocine, une méthode de mutagenèse aléatoire par PCR a été mise en place pour générer des séquences d'ADN, codant la bactériocine mature, modifiées sur un seul codon. Dans un deuxième temps, une méthode de production hétérologue de ces peptides mutés a été développée en utilisant d'une part un vecteur portant les gènes de structure des bactériocines, et d'autre part, un vecteur permettant l'expression de l'immunité et du transport de ces peptides. Un outil de production universelle de peptide a été élaboré. L'étude de l'impact des mutations sur l'activité antagoniste, la structure secondaire (analysée par dichroïsme circulaire en présence de trifluoroéthanol ou de micelles de lysophosphatidylcholine), la structure tridimensionnelle (prédite) et l'interaction de la mésentéricine Y105 avec des environnements mimant les membranes cibles (méthode d'extinction de la fluorescence intrinsèque du tryptophane) a été réalisée. Enfin, une analyse par résonance magnétique nucléaire (RMN) a été effectuée sur la bactériocine sauvage pour déterminer sa structure tridimensionnelle. De l'ensemble de ces données, un modèle d'action est proposé pour la mésentéricine Y105, ce modèle peut être étendu aux bactériocines de structure proche