Détection et identification de sélénoprotéines par électrophorèse sur gel associée aux spectrométries de masse atomique et moléculaire

Abstract

Selenium is a trace element known for its necessity in organisms' development and its beneficial roles in human health. Research in the past five years strengthened the idea that these properties are largely due to the synthesis of selenoproteins in living organisms. Classical methods in proteomics are not adapted to identify minor selenoproteins. In this PhD work, more sensitive and more specific methods complementary to proteomics have been developed for their detection and identification. A stable selenized protein standard has been produced to develop these methods. The development of laser ablation - Inductively Coupled Plasma - Mass spectrometry coupling (LA-ICP-MS) lead to the detection of selenoproteins after separation by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Conventional device of laser ablation has been used and then improved with a new device using femtoseconde laser with ultrafast scanning for more sensitive detection of selenoproteins in biological samples. Once detected, selenoproteins have been identified by molecular mass spectrometry. For this purpose selenopeptids from enzymatic digestion of selenoproteins have been detected first by nanochromatography coupled to ICP-MS and sequenced then by means of by nanochromatography coupled to electrospray ionisation tandem mass spectrometry (nanoHPLC-ESI-MS/MS). LA-ICP-MS device has been successful for detection of new selenoproteins in Desulfococcus multivorans bacteria. This identification procedure has been validated on two purified selenoproteins thioredoxin reductase and carboxymathylated glutathion peroxidase. This developed methodology will lead to identification of selenoproteins and a better understanding of the physiological role of these molecules in numerous living organisms.Le sélénium est un élément trace connu pour son caractère essentiel au développement de nombreux organismes vivants mais également pour ses effets bénéfiques sur la santé humaine. Les recherches effectuées ces cinq dernières années ont renforcé l'idée que ces propriétés seraient dues à la synthèse de sélénoprotéines chez les êtres vivants. Les méthodes classiques d'analyse protéomique ne sont pas adaptées à l'identification ciblée de ces sélénoprotéines très minoritaires. Les travaux de cette thèse ont consisté à développer des méthodes complémentaires plus spécifiques et sensibles en vue de leur détection et de leur identification. Un étalon protéique sélénié stable a été produit pour développer ces méthodes. Le couplage de l'ablation laser et de la spectrométrie de masse couplée à un plasma induit (LA-ICP-MS) a été mis en oeuvre pour la détection des sélénoprotéines après une séparation par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE). Le dispositif d'ablation laser conventionnel a ici été amélioré avec un laser femtoseconde à balayage très rapide permettant une détection plus sensible des sélénoprotéines dans les échantillons biologiques. Une fois détectées, les sélénoprotéines ont été identifiées en spectrométrie de masse moléculaire. Pour cela les sélénopeptides issus de la digestion enzymatique des sélénoprotéines sont d'abord repérés en nanochromatographie couplée à l'ICP-MS puis séquencés en nanochromatographie couplée à la spectrométrie de masse en tandem à ionisation électrospray (nanoHPLC-ESI-MS/MS). La procédure en LA-ICP-MS développée a notamment permis la détection de nouvelles sélénoprotéines chez la bactérie Desulfococcus multivorans. La procédure d'identification a été validée sur deux sélénoprotéines purifiées thiorédoxine réductase et glutathione peroxydase carboxyméthylée. La méthodologie développée contribuera à l'identification de nouvelles sélénoprotéines pour une meilleure compréhension des rôles physiologiques de ces molécules chez de nombreux êtres vivants