Régulation de la signalisation TRAIL par l'ezrine

Abstract

Background and Aim: TRAIL has sparked a growing interest in oncology due to its ability to selectively trigger cancer cell death while sparing normal cells. The Fas/actin association through ezrin, a member of the ERM protein family, has been reported to regulate early steps of Fas-mediated apoptosis. In this project, we addressed the role of ezrin regarding TRAIL-induced cell death in B lymphoma cell lines, or adherent cancer cell lines (HeLa WT, HCT116, SW480). Methods: Molecular and biochemical approaches were employed to study the relevance of ezrin and its phosphorylation status in TRAIL signaling. Results: We found that ezrin displays a negative function towards TRAIL- and Fas-mediated apoptosis and that the ezrin-mediated TRAIL-induced cell death inhibition led to ezrin activation through phosphorylation/dephosphorylation events at serine 66 and tyrosine 353, but is mainly independent of TRAIL DISC (Death Inducing Signalling Complex) formation or activation. Mutations of these residues to alanine (S66A) or aspartic acid (Y353D) selectively enhanced TRAIL-induced cell death, whereas point mutations mimicking ezrin phosphorylation on S66 (S66D) or a nonphosphorylable variant on Y353 (Y353F) strongly protected cancer cells from apoptosis induced by TRAIL. Moreover, inhibition of the ezrin serine 66 PKA target site, using H89, increased cancer cell sensitivity to TRAIL, while treatment with 8bromocyclic AMP, a PKA activator, decreased TRAIL-induced cell death. In addition, combined TRAIL/cisplatin treatments abrogated ezrin-mediated inhibition of TRAIL-induced apoptosis.Objectifs: La cytokine TRAIL (TNF Related Apoptosis Inducing Ligand) suscite un intérêt majeur en thérapie anti-cancéreuse grâce à sa capacité à induire l’apoptose des cellules cancéreuses tout en épargnant les cellules saines. L’association du récepteur Fas et de l’actine via l’ezrine, une protéine de la famille ERM (Ezrin, Moesin, Radixin), régule les premières étapes de l’induction de l’apoptose par FasL. Au cours de mon projet de thèse, nous avons voulu déterminer le rôle que pouvait jouer l’ezrine au cours de l’apoptose induite par TRAIL, dans des lymphomes B ou des cellules cancéreuses adhérentes (HeLa, HCT116 et SW480). Matériel et Méthodes: Des approches biochimiques et moléculaires nous ont permis d’étudier et de déterminer l’implication de l’ezrine et sa phosphorylation dans la régulation de la mort induite par TRAIL. Résultats: Ce travail démontre que l’ezrine peut réguler de manière négative l’apoptose induite par TRAIL et FasL. Cette activité inhibitrice est régulée par la phosphorylation/déphosphorylation sur la serine 66 ainsi que sur la thréonine 353. Néanmoins cette régulation n’affecte ni la formation, ni l’activation du DISC (Death Inducing Signalling Complex). Des mutations de ces résidus par une alanine (S66A) ou un acide aspartique (Y353D) augmente sélectivement la capacité de TRAIL à induire l’apoptose. Au contraire, des mutations ponctuelles de ces résidus permettant de mimer la phosphorylation de l’ezrine sur la serine 66 (S66D) ou l’expression d’un variant non phosphorylable sur la thréonine 353 (Y353F) protègent les cellules cancéreuses de l’apoptose induite par TRAIL. De manière concordante, l’utilisation du H89, un inhibiteur de PKA, kinase responsable de la phosphorylation de la serine 66 augmente la sensibilité des cellules cancéreuses à TRAIL, alors qu’au contraire, un activateur de PKA (8bromocyclic AMP) rend ces mêmes cellules plus résistantes à TRAIL. Enfin, l’association de TRAIL et du cisplatine permet de dépasser l’inhibition de l’apoptose par l’ezrine