Caractérisation moléculaire d'une sulfatase, d'une kappa-carraghénase et d'une iota-carraghénase chez deux bactéries marines : Alteromonas carrageenovora et Cytophaga Drobachiensis

Abstract

Genomic libraries from three carrageenan-degrading marine bacteria Alteromonas carrageenovora, Alteromonas fortis and Cytophaga drobachiensis were realised to study carrageenase genes and their protein structures. A gene encoding a sulfatase from A. carrageenovora (ATCC 43555) which is not inhibited by inorganic sulfate, was cloned. The nucleotide sequence of the sulfatase gene (atsA) was determined. This study suggests that this sulfatase is not the glycosulfatase which desulfates the end-products obtained upon cleavage of kappa-carrageenan by the kappa-carrageenase but is a arylsulfatase. Sequence comparisons did not reveal any homology with know proteins.The nucleotide and deduced amino acid sequences are reported for the structural gene cgkA for kappa-carrageenase (Mr 44 412 Da) from the marine bacterium Alteromonas carrageenovora. The cgkA gene encodes a protein of 397 amino acids, and a signal pectide of 25 amino acids were found. These results suggest that the protein would cut twice to be exported. The enzyme is a new member of glycosyl-hydrolases family 16 which comprises glucanases from various sources and the ß-agarase from Streptomyces coelicolor. It is proposed that residue Glu163 in the kappa-carrageenase from A. carrageenovora and Glu155 in the ß-agarase from S. coelicolor are important for catalysis. These latter data show that proteins with similar tertiary structure hydrolyse differents substrates. The DNA fragment for the iota-carrageenase from C. drobachiensis encodes a protein with a molecular mass nearly similar to the exported protein. However, the N-terminus does not directly follows the peptide-signal. This suggest that, here also, the protein would be cut twice before being exported. There is no Shine-Dalgarno sequence, but the Omega and Epsilon sequences, observed upstream of the ORF, could initiate the traduction. No homology was found with other protein sequences.Afin d'étudier la structure des carraghénases bactériennes, des banques génomiques ont été construites à partir des bactéries marines carraghénolytiques Alteromonas carrageenovora, Alteromonas fortis et Cytophaga drobachiensis. Un gène codant pour une sulfatase (atsA) dans A. carrageenovora (ATCC 43555), non inhibée par le sulfate inorganique, a été cloné. Sa séquence nucléotidique a été déterminée. L'étude de cette sulfatase démontre qu'elle n'est pas la glycosulfatase qui désulfate les produits terminaux d'hydrolyse issus de l'action de la kappa-carraghénase, mais est une arylsulfatase supplémentaire dans cette bactérie. La protéine déduite de la séquence du gène ne montre aucune homologie avec d'autres protéines connues. Les séquences nucléotidique et protéique du gène cgkA codant la kappa-carraghénase de A. carrageenovora (Mr 44412 Da) sont présentées. Ce gène code pour une protéine de 397 acides aminés et un peptide signal de 25 acides aminés a été identifié. L'enzyme pourrait être coupé deux fois lors de son excrétion. La kappa-carraghénase montre des homologies avec diverses glucanases de la famille 16 des glycosidases ainsi qu'avec la ß-Glu155 dans la ß-agarase de Streptomyces coelicolor. Les résidus Glu163 dans la kappa-carraghénase et Glu155 dans la ß-agarase seraient catalytiques. Ces résultats indiquent que des protéines ayant des structures tertiaires similaires peuvent avoir des spécificités de substrat différentes. L'insert de la iota-carraghénase de C. drobachiensis code pour une protéine qui aurait une masse moléculaire approximativemet égale à celle de l'enzyme excrétée. Cependant, son extrémité NH2 ne fait pas directement suite au peptide signal. Ceci suggère que, là aussi, une seconde coupure pourrait être nécessaire à son excrétion. Il n'y a pas de séquence de Shine-Dalgorno en amont du gène de la iota-carraghénase mais les séquences appelées Oméga et Epsilon pourraient initier la traduction. Aucune homologie avec d'autres protéines connues n'a été trouvée