Bereta, Joanna

Guzdek, Amalia

Jemioła-Rzemińska, Małgorzata

Jura, Jolanta

Kasza, Aneta

Kruk, Jerzy

Mak, Paweł

Myśliwa-Kurdziel, Beata

Szymańska, Renata

Waloszek, Andrzej

Węgrzyn, Paulina

Polish

Jagiellonian Univeristy Repository

1. Wprowadzenie do zajęć z biochemiiCelem tych ćwiczeń jest zapoznanie studenta ze specyfiką pracy w laboratorium bio­chemicznym, ze szczególnym uwzględnieniem zasad bezpieczeństwa. Studenci zapo­znają się (za pisemnym potwierdzeniem) z instrukcją BHP oraz ze szczegółowymi zasadami postępowania obowiązującymi na zajęciach, które omawia prowadzący. Dla większości studentów nowością jest korzystanie z pipet automatycznych, dlatego na pierwszych ćwiczeniach uczą się posługiwania tymi pipetami. Dodatkowym celem zajęć jest sprawdzenie umiejętności przeliczania stężeń i rozwiązywania prostych zadań. Umiejętność przeliczania stężeń i sporządzania roztworów jest bowiem nie­zbędna w laboratorium biochemicznym oraz w toku dalszych studiów. Przykłady ty­powych zadań związanych z takimi przeliczeniami podano poniżej. INSTRUKCJA BEZPIECZEŃSTWA W STUDENCKIM LABORATORIUM BIOCHEMICZNYMI.  UWAGI OGÓLNE1. W laboratorium mogą przebywać studenci, którzy zaliczyli szkolenie ogólne BHP oraz szkolenie specjalistyczne przed rozpoczęciem zajęć danego typu (za po­twierdzeniem). 2. Ćwiczenia laboratoryjne mogą odbywać się wyłącznie pod nadzorem osoby pro­wadzącej zajęcia; bez jej wiedzy nie wolno przeprowadzać żadnych doświadczeń. 3. Przebywając w laboratorium należy zawsze nosić fartuch laboratoryjny zapięty oraz okulary (korekcyjne lub ochronne). Długie włosy należy nosić spięte. 4. W laboratorium występują następujące zagrożenia: 1) substancje niebezpieczne: (wysoce) łatwopalne (np. aceton F); żrące (np. kwasy i zasady stężone C), rakotwórcze i mutagenne (np. benzen, kat. 1), (bardzo) toksyczne (np. cyjanki T+), szkodliwe (Xn), drażniące (Xi), niebez­pieczne dla środowiska (np. roztwory bromu N); 2) czynniki chemiczne; pary substancji toksycznych (szkodliwych) drażniących w trakcie ich przelewania; 3) czynniki fizyczne: promieniowanie UV emitowane przez lampę do oglądania preparatów. 5. Karty charakterystyki substancji i preparatów niebezpiecznych znajdują się w laboratorium na tablicy informacyjnej. 8 Praktikum z biochemii6. Wszelkie czynności przy stosowaniu substancji niebezpiecznych (w szcze­gólności stężonych kwasów i zasad oraz substancji lotnych) należy wykonywać pod dygestorium, nosząc okulary i rękawice ochronne. II.  PODSTAWOWE CZYNNOŚCI PRZED ROZPOCZĘCIEM PRACY1.  Przed przystąpieniem do pracy należy zapoznać się z procedurą wykonywania doświadczenia oraz z właściwościami fizykochemicznymi stosowanych substan­cji i preparatów niebezpiecznych. Informacje szczegółowe znajdują się w kartach charakterystyki. III.  ZASADY BEZPIECZNEGO WYKONYWANIA PRACY1. W celu wyeliminowania pomyłek wynikających z użycia niewłaściwych odczyn­ników, należy wyrobić sobie nawyk dwukrotnego odczytywania etykiety na bu­telce. Nie wolno pozostawiać butelek otwartych, ani odkładać korków na stół, aby nie dochodziło do zamiany korków. Pobranych roztworów nie wolno zlewać z powrotem do butelek, zktóiych roztwór został pobrany. 2. Wszelkie rozlania substancji niebezpiecznych należy natychmiast zetrzeć ręcz­nikiem papierowym. 3. Roztwory należy pobierać pipetami automatycznymi (stosując zawsze czyste końcówki) lub pipetami szklanymi zaopatrzonymi w pompkę/gruszkę gumową. Nie wolno aspirować ustami! Pipety szklane należy natychmiast opłukać. Zużyte końcówki plastikowe należy odłożyć do wyznaczonego pojemnika lub według in­strukcji. 4. Płyny ogrzewane w probówce należy stale mieszać, aby nie doszło do przegrza­nia cieczy - co może spowodować gwałtowne jej wyrzucenie. Wylotu probówki nie wolno kierować ani na siebie, ani na kolegów, nie należy się też nachylać nad naczyniem z ogrzewanym płynem, zaglądać do probówki, itp. 5. Przed wirowaniem należy upewnić się, czy rotor jest wyważony (masa przeciw­ległych probówek lub probówek i pojemnika powinna być jednakowa), a także czy na dnie pojemnika znajdują się gumowe podkładki. 6. Przy stosowaniu lampy promieniowania UV nie wolno kierować światła lampy na oczy (wszystkie osoby w laboratorium noszą okulary ochronne). 7. Za wyjątkiem substancji wymienionych w pkt. 8. — zużyte roztwory należy wy­lewać do zlewu przy otwartym strumieniu wody. Zlew należy spłukać. 8. Zużyte roztwory substancji toksycznych i niebezpiecznych dla środowiska moż­na zlewać wyłącznie do wyznaczonych pojemników. UWAGA: wylanie roztwo­ru cyjanku do zlewu lub do roztworu kwaśnego może spowodować gwałtowne wydzielenie się cyjanowodoru i zatrucie ze skutkiem śmiertelnym. Praktikum z biochemii 99.  Uszkodzone szkło laboratoryjne należy wkładać do oznakowanych worków lub pojemników — w celu utylizacji. V. CZYNNOŚCI PO ZAKOŃCZENIU PRACY1.  Po skończonej pracy student powinien umyć szkło laboratoryjne, odstawić od­czynniki na właściwe miejsce, stół laboratoryjny pozostawić czysty i suchy oraz umyć ręce wodą i mydłem. VI. UWAGI KOŃCOWE1. W pracowni nie wolno spożywać pokarmów i płynów, żuć gumy ani palić tytoniu (zasada ogólna).2. W miejscu pracy należy zachowywać porządek. Na stole laboratoryjnym nie na­leży kłaść przedmiotów nie związanych z wykonywanym doświadczeniem (np. książek). W laboratorium należy zachować spokój.3. Każda awaria urządzenia lub instalacji winna być niezwłocznie zgłoszona pro­wadzącemu. Nie wolno uruchamiać maszyn i urządzeń oznakowanych jako nie­sprawne.4. Pierwsza pomoc: W przypadku oblania ciała substancją chemiczną należy na­tychmiast spłukać to miejsce obficie wodą, a dopiero potem podjąć kroki zale­cane w karcie charakterystyki.Apteczka wraz z ogólną instrukcją udzielania pierwszej pomocy znajduje się w sali nr C 139. Osobą odpowiedzialną za organizację udzielenia pierwszej po­mocy jest pracownik prowadzący zajęcia.5. O każdym zaistniałym wypadku studenta należy natychmiast powiadomić pro­wadzącego zajęcia, który ma obowiązek zawiadomić Inspektorat BHP. Jeżeli za­chodzi potrzeba konsultacji lekarskiej, studentowi powinien towarzyszyć pra­cownik (nie inny student). Do lekarza należy zabrać kartę charakterystyki substancji, która była przyczyną wypadku. Stanowisko pracy, jeżeli nie stwarza zagrożenia, należy pozostawić w niezmienionym stanie — w celu dochodzenia przyczyn, prowadzonego przez pracowników Inspektoratu BHP UJ.6. Ochrona przeciwpożarowa i ewakuacja: W laboratorium znajdują się na­tryski ratunkowe, służące do spłukania substancji niebezpiecznej przy oblaniu ciała. Gaśnice znajdują się w korytarzu w miejscach oznakowanych. Ńie wolno zastawiać dostępu do tych urządzeń. W przypadku alarmu należy natychmiast wyłączyć urządzenia elektryczne i opuścić budynek drogą ewakuacyjną.Zatwierdzone i podpisane kopie Instrukcji są wywieszone w studenckich labora­toriach biochemicznych.10 Praktikum z biochemiiZASADY PIPETOWANIA NASTAWNYMI PIPETAMI AUTOMATYCZNYMINastawne pipety automatyczne pozwalają na dokładne pipetowanie różnych objęto­ści płynów. Istnieje kilka typów pipet różniących się zakresem odmierzanych objęto­ści: 0,2-2 pl, 0,5-10 pl, 2-20 pl, 20-200 pl, 200 pl -1 ml, 1-5 ml. W trakcie ćwi­czeń z biochemii stosowane są najczęściej pipety o zakresach: 2-20 pl, 20-200 pl, 200 pl -1 ml.Na trzonek pipety nakłada się plastikową końcówkę. Tłoczek pipety ma dwa punk­ty oporu. Przy pobieraniu płynu do końcówki tłoczek naciskamy tylko do pierwszego punktu oporu, zanurzamy w roztworze, stopniowo zwalniamy tłoczek. Gdy wypusz­czamy płyn z pipety tłoczek naciskamy do drugiego punktu oporu. Częstym błędem przy pipetowaniu jest naciąganie płynu przy tłoczku naciśniętym do drugiego punktu oporu - wówczas pobrana objętość płynu jest większa od nastawionej na pipecie.Na co trzeba zwracać uwagę przy pipetowaniu:1. Końcówka powinna być mocno osadzona na trzonku; w przeciwnym razie pipeta naciąga i płyn i powietrze a zatem objętość płynu jest mniejsza od przewidywanej.2. Końcówkę pipety zanurzamy w pobieranym płynie jak najpłycej, aby jak najmniej płynu pozostawało na zewnętrznych ściankach końcówki. Waż­ne jest, aby cały czas podczas pipetowania była zanurzona w płynie.3. Płyn pobieramy łagodnym ruchem, tak aby nie wciągnąć go do trzonka pipety (a tylko do końcówki).4. Pipetę trzymamy skierowaną końcówką w dół; nie wolno odkładać na bok pipety z nabranym płynem.5. Po pobraniu płynu, sprawdzamy orientacyjnie czy w końcówce jest prze­widziana ilość płynu. Nabierając doświadczenia w pipetowaniu, potrafimy określić czy rzeczywiście w końcówce pipety znajduje się 2, 20 czy 200 pl. Jeśli mamy wątpliwości, powtarzamy pipetowanie.6. Płyn wypuszczamy z pipety naciskając tłoczek do drugiego punktu oporu. Jeśli przygotowujemy rozcieńczenia i pipetujemy małe objętości, warto wypuszczać płyn od razu do rozcieńczalnika. W innym przypadku należy sprawdzić, czy kropla płynu wypuszczana z pipety znalazła się na dnie probówki i czy nie została z powrotem wciągnięta do pipety.7. Dokładność działania pipety można okresowo sprawdzać wykorzystując wagę analityczną i ważąc pobierane przez pipetę objętości wody destylo­wanej.ZAGADNIENIA DO OPRACOWANIA:• Stężenia procentowe wagowo-wagowe (w/w) i wagowo-objętościowe (w/o).• Stężenie molowe — jednostki (M, mM, pM, nM, pM, fM).• Jednostki masy i objętości (kg, g, mg, pg; dm3 (1), cms (ml), mms (pl).• Sporządzanie roztworów, przygotowywanie rozcieńczeń.• Prawo Lamberta-Beera.• Zadania do opanowania.Praktikum z biochemii 11SPOSOBY WYRAŻANIA STĘŻEŃ1. Stężenie procentowe — odnosi się do masy substancji i masy roztworu, infor­muje o liczbie gramów substancji zawartej w 100 g roztworu (procent wagowo- wagowy, w/w). Zastosowanie ma również procent wagowo-objętościowy, w/o Oiczba gramów substancji zawarta w 100 ml roztworu).2. Stężenie molowe — to liczba moli substancji rozpuszczonej w i dm3 roztworu. Roztwór zawierający i mol substancji w i dm3 to roztwór jednomolowy, co można zapisać albo jako stężenie 1 mol/dm3 albo i M.Nie należy mówić: „roztwór o stężeniu 10 milimoli” ani „roztwór 10 milimolarny”. Prawidłowe sformułowania to: roztwór dziesięciomilimolowy albo roztwór o stężeniu 10 mmoli/dm3.Do przeliczenia stężenia molowego na procentowe albo stężenia procentowego na molowe często potrzebna jest znajomość gęstości roztworu. Gęstość roztworu wyra­żamy w g/cm3 lub w kg/dm3. W przypadku roztworów wodnych o niewielkim stęże­niu można przyjąć gęstość roztworu jako równą gęstości wody (i g/cm3).PRZYKŁADY ZADAŃ DO OPANOWANIA3. Ile należy odważyć NaOH aby przygotować 150 ml dwumolowego roztworu?4. Obliczyć stężenie molowe NaCl, jeśli w 200 ml roztworu znajduje się 3,5 g tego związku.5. Stężony kwas H2SO4 jest 96% (procent wagowy) i ma gęstość 1,84 g/cm3. Obli­czyć objętość stężonego kwasu potrzebną do sporządzenia (i) 500 ml 2M H2SO4 (ii) 100 ml 12% roztworu.6. Jak przygotować 500 ml 0,2 M roztworu HC1? Stężony HC1 jest 37,5% (pro­cent wagowy) i ma gęstość 1,19 g/cm3.7. Ilu molowy roztwór NaOH otrzymamy po zmieszaniu 50 ml dwumolowego roztworu NaOH z 120 ml 0,75 molowego roztworu NaOH?8. 12,5 g NaCl rozpuszczono w 150 ml H20. Podaj stężenie procentowe roztworu (procent wagowo-objętościowy).9. W120 g roztworu znajduje się 7,5 g NaCl. Ilu procentowy jest to roztwór?10. Do 15 g 15% roztworu dodano 120 g H20. Podaj stężenie procentowe otrzyma­nego roztworu.1.1. Przygotowanie serii roztworów K2Cr2O7 o różnym stężeniuZASADA:Dokładność pipetowania można sprawdzić przez pomiar absorbancji roztworów przygotowanych w oparciu o roztwór wyjściowy barwnej substancji, np. chromianu (VI) potasu.Absorbancja (gęstość optyczna) jest miarą absorpcji promieniowania przez daną substancję i wyraża się wzorem:A = log ygdzie: A — absorbancja, Io — natężenie światła padającego, I — natężenie światła po przejściu przez ośrodek pochłaniający światło.12 Praktikum z biochemiiJeśli ośrodkiem pochłaniającym światło jest roztwór jakiejś substancji, to absor- bancja będzie zależała od grubości warstwy ośrodka, stężenia substancji i jej właści­wości optycznych. Tę zależność opisuje prawo Lamberta-Beera: A = cx1xegdzie: A — absorbancja, c — stężenie substancji, 1 - grubość warstwy, przez którą przechodzi światło, e — molowy współczynnik absorpcji. Różne substancje w różnym stopniu pochłaniają światło o różnej długości fali. Dla każdej substancji można wyznaczyć molowy współczynnik absorpcji światła o danej długości fali. Jest on równy absorbancji jaką wykazuje roztwór substancji o stężeniu i mol/dms przy grubości warstwy równej i cm. Znając molowy współczynnik absorpcji dla danej substancji i mierząc absorbancję roztworu tej substancji można obliczyć jej stężenie. Ponieważ absorbancja jest wprost proporcjonalna do stężenia substancji, można pomiar absorbancji roztworów wykorzystać do sprawdzenia dokładności pipetowania. WYKONANIE A (z użyciem probówek i spektrofotometru): Przygotować 5 probówek i do każdej odpipetować po 1 ml wody. Przygotować serię różnych stężeń chromianu dodając do powyższych probówek 2, 4, 6, 8, 10 ml wyj­ściowego roztworu K2Cr2O7 (20 mg/ml). Zmierzyć absorbancję roztworów przy dłu­gości fali 410 nm względem wody. Wykreślić krzywą zależności absorbancji od stęże­nia K2Cr2O7. Pierwszy punkt krzywej to punkt o współrzędnych (o, o). Jeśli któryś z punktów doświadczalnych odbiega znacząco (o 20%) od wartości wyznaczonej z równania otrzymanej prostej, powtórzyć doświadczenie. WYKONANIE B (z użyciem 96-studzienkowej mikroplytki testowej, przedstawio­nej na poniższym schemacie i czytnika do mikropłytek): Studenci pracujący w podgrupach mogą kolejno korzystać z tej samej płytki. Pierw­sza podgrupa studentów wykorzystuje rząd 1 i 2, druga podgrupa rząd 3 i 4, trzecia — 5 i 6 itd. Praktikum z biochemii 13Do dwóch kolejnych studzienek w szeregu A (np. Al i A2) odpipetować po 200 pl wody, do dwóch studzienek szeregu B po 198 pi wody i do kolejnych studzienek sze­regów C, D, E i F odpipetować odpowiednio po 196, 194, 192 i 190 pl wody. Następ­nie do dwóch studzienek szeregu B zawierających wodę odpipetować po 2 pl roztwo­ru wyjściowego K2Cr2O7 (20 mg/ml); do studzienek szeregu C — po 4 pl i do studzienek kolejnych szeregów: po 6, 8 i 10 pl roztworu wyjściowego K2Cr2O7. Zmie­rzyć absorbancję roztworów na czytniku do płytek przy 410 nm względem wody. Ob­liczyć średnią absorbancję i odchylenie standardowe dla duplikatów przygotowanych dla każdego rozcieńczenia. Wartość odchylenia standardowego nie powinna przekra­czać 10% wartości zmierzonych absorbancji. Wykreślić krzywą zależności absorban- cji od stężenia K2Cr2O7. Pierwszy punkt krzywej to punkt o współrzędnych (o, o). Powtórzyć doświadczenie, jeśli dla któregoś z punktów odchylenie standardowe przekracza 20% wartości absorbancji lub któryś z punktów doświadczalnych odbiega znacząco od wartości wyznaczonej z równania otrzymanej prostej. UWAGA: należy unikać tworzenia baniek powietrza w studzienkach. 1. 2.  Metoda seryjnych rozcieńczeńZASADA: W wielu doświadczeniach wykorzystuje się seryjne rozcieńczenia badanych prepara­tów lub standardów. Przygotowuje się kilka roztworów, w których stężenie danej substancji w próbce nr 1 jest wielokrotnością stężenia tej substancji w próbce nr 2, które z kolei jest tą samą wielokrotnością stężenia w próbce 3 itd. Na przykład można przygotować serię dwukrotnych albo dziesięciokrotnych rozcieńczeń roztworu wyj­ściowego. Przy serii dwukrotnych rozcieńczeń roztworu o stężeniu 1%, uzyskamy roz­twory: 0, 5%; 0, 25%; 0, 125%; 0, 0625%; 0, 0313% itd. Przy serii dziesięciokrotnych rozcieńczeń roztworu 100 mM uzyskamy roztwory o stężeniach: 10 mM, 1 mM, 100 |uM, 10 |1M, 1 pM, 100 nM itd. WYKONANIE: Przygotować 2 ml 25 x rozcieńczonego wyjściowego roztworu K2Cr2O7 (80 pl + 1, 920 ml wody) — probówka nr 1. Jakie jest stężenie K2Cr2O7 w tym roztworze? Przygotować serię dwukrotnych rozcieńczeń tego roztworu. Do 5 probówek (oznaczonych numera­mi 2-6) odmierzyć po 1 ml wody. Z probówki nr 1 pobrać 1 ml roztworu K2Cr2O7 i przenieść do probówki nr 2, wymieszać zawartość probówki, pobrać 1 ml i przenieść do probówki nr 3. Wymieszać zawartość probówki nr 3 i przenieść 1 ml do probówki nr 4 itd. Zmierzyć absorbancję roztworów przy 410 nm, względem wody. Wykreślić krzywą zależności absorbancji od stężenia K2Cr2O7. Pierwszy punkt krzywej to punkt o współrzędnych (0, 0). Powtórzyć doświadczenie, jeśli któryś z punktów doświadczal­nych odbiega znacząco od wartości wyznaczonej z równania otrzymanej prostej. ODCZYNNIKI: Roztwór K2Cr2O7o stężeniu 20 mg/ml. SPRZĘT LABORATORYJNY: Spektrofotometr, czytnik do mikropłytek. 14 Praktikum z biochemii

Wprowadzenie do zajęć z biochemii

https://ruj.uj.edu.pl/xmlui/bitstream/handle/item/252720/guzdek_mak_wprowadzenie_do_zajec_z_biochemii_2009.pdf?sequence=1&isAllowed=y

Wprowadzenie do zajęć z biochemii

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Jagiellonian Univeristy Repository