Structural studies of new β-lactoglobulin variants possessing tryptophan mutations in the binding site

Abstract

Lipokaliny to niewielkie białka zdolne do transportowania małych, hydrofobowych molekuł. Białka z rodziny lipokalin posiadają wysoce konserwatywny motyw β-baryłki tworzący sztywny rdzeń. Do tej rodziny należy β-laktoglobulina, która jest białkiem globularnym, występującym w serwatkowej frakcji mleka wielu ssaków. Białko to wykazuje wysokie powinowactwo do hydrofobowych ligandów, których centralnym miejscem wiązania jest β-baryłka. Nowe warianty β-laktoglobuliny, dla których prowadzono badania strukturalne w ramach tej pracy, zawierały wielokrotne mutacje w rejonie kieszeni wiążącej, w tym substytucje wybranej reszty aminokwasowej na tryptofan. Zaprojektowane mutanty białka posiadały zmienioną geometrię miejsca wiążącego, co powodowało zwiększenie powinowactwa do trójcyklicznych leków. Celem pracy było znalezienie odpowiednich warunków krystalizacji i otrzymanie monokryształów kompleksów nowych wariantów β-laktoglobuliny z lekami o trójcyklicznej geometrii. Podjęto próby krystalizacji dwóch wariantów β-laktoglobuliny: I56F/L39A/M107W oraz F105L/L39A/M107W. Krystalizację prowadzono metodą dyfuzji przez fazę gazową, techniką wiszącej kropli. Warunki krystalizacji optymalizowano, zmieniając stężenie roztworów białka i precypitanta oraz skład kropli.Lipocalins are small proteins which can transport hydrophobic molecules. Proteins from the lipocalin family have a well conserved β-barrel motif, forming a rigid protein core. β-lactoglobulin, found in the whey of many mammals is the globular protein belonging to the lipocalin family,. This protein has a high affinity to hydrophobic ligands which are bound in the β-barrel. Structural investigations were made for the new β-lactoglobulin variants containing multiple mutations introduced into the binding pocket, including tryptophan substitution of the selected residues. These substitutions altered the geometry of the binding pocket in order to increase protein affinity to drugs of tricyclic geometry. The aim of the studies was to find optimal conditions for crystallization of new β-lactoglobulin variants with drugs of tricyclic geometry. Crystallization of two lactoglobulin variants: I56F/L39A/M107W, F105L/L39A/M107W and their complexes with ligands were performed. Protein-ligand complexes were crystallized by the vapour diffusion method, hanging drop technique. In order to obtain high quality crystals, the crystallization conditions were optimized by modifying the concentration of protein, precipitant and the composition of the drop