Janeczko, Zbigniew

Szybka-Hrynkiewicz, Przemysław

BioTechnologia

Polish

Jagiellonian Univeristy Repository

PRACE EKSPERYMENTALNEAdres do korespondencjiPrzemysław Szybka-Hrynkiewicz, Katedra Farmakognozji, Collegium Medicum, Uniwersytet Jagielloński, ul. Medyczna 9,30-688 Kraków.biotechnologia2 (65) 93-99 2004Densytometryczna analiza diosgeniny w ekstraktach z tkanki kalusowej Polygonatum verticillatum (L.) Ali.Przemysław Szybka-Hrynkiewicz, Zbigniew JaneczkoKatedra Farmakognozji Collegium Medicum, Uniwersytet jagielloński KrakówDensitometric analysis of diosgenin in extracts from callus tissue of Polygonatum verticillatum (L.) All.SummaryIn this study, we examined the effect of plant growth regulators (2, 4-D, 6-BAP) and steroidal hormone (17-p-estradiol) on a quantity of diosgenin in cal­lus tissue of Polygonatum verticillatum (L.) All.The callus grown in in vitro conditions on MS medium with; 1/1, 2/2, 5/5, 10/10 (lmg/dm31 2,4-D/lmg/dm3] 6-BAP) and 1/1/1,2/2/2, 5/5/5, 10/10/10 ([mg/dm31 2,4-D/(pM/dm3j 17-p-estradiol/(mg/dm3) 6-BAP) was used for the densitometric analysis to determine the presence of diosgenin. The content of diosgenin ranged from 0,0642 to 1,1458%. An increase in diosgenin content due to addi­tion of 6-BAP and 2,4-D was observed. The developed procedure was estimated by statistical analysis which indicates that it can be used for routine analysis.Key words:callus, in vitro culture, diosgenin, 2,4-D, 6-BAP, 17-p-estradiol, auxins, cytokinins, Polygonatum verticillatum, densitometric analysis.1. WstępW badaniach przeprowadzonych w Katedrze Farmakognozji CM UJ (1) stwierdzono, że Polygonatum verticillatum (L.) Ali. - kokoryczka okółkowa oraz inne występujące na terenie Polski gatunki rodzaju Polygonatum zawierają saponozydy steroidowe. Związki te, a w zasadzie ich aglikon - diosgeninę, wykorzystuje sięPrzemysław Szybka-Hrynkiewicz, Zbigniew JaneczkoW półsyntezie hormonów steroidowych. Przekształcenie diosgeniny w progesteron jest wynikiem acetylacji, utleniania, hydrolizy alkalicznej i utleniania Oppenauera (2,3). Dotychczas, do izolacji tego związku na skalę przemysłową wykorzystywane są najczęściej gatunki rodzaju Dioscorea rosnące w strefie klimatu tropikalnego.Należy podkreślić, że zawartość diosgeniny w kłączach gatunków rodzaju Dioscoreo, gdzie występuje ona średnio w ilości od 2 do 8% (4,5), jest znacznie wyższa niż w tkankach gatunków występujących lub uprawianych w Polsce.W krajowych roślinach lub w Polsce uprawianych, obecność diosgeniny stwier­dzona została: w nasionach Trigonello coeruleo Ser. - kozieradka błękitna (0,2-0,8%) (6), w nasionach Trigonella foenum-graecum L. - kozieradka pospolita (0,2-0,8^) (6), w tkance kalusowej Trigonella foenum-graecum L. (0,1-0,16%) (7), w zielu i kłączach Maianthemum bifolium L. - konwalijka dwulistna (8), w podziemnych i nadziemnych organach wegetatywnych Polygonatum multiflorum (L.) Ali. - kokoryczka wielokwia­towa i Polygonatum odoratum (Mili.) Druce - kokoryczka wonna (w obu gatunkach znikoma zawartość diosgeniny) (1,9) oraz w Polygonatum verticillatum (L.) Ali. - ko­koryczka okółkowa (1,4-3,17%) (1).Podobieństwo budowy diosgeniny do progesteronu uzasadnia pozyskiwanie jej z roślin w celu produkcji hormonów płciowych i kortykosteroidów. Z przebadanych do tej pory krajowych gatunków najwyższą zawartość tego związku wykazuje koko­ryczka okółkowa - Polygonatum verticillatum (L.) Ali. Roślina ta, jak dotychczas, jest jedyną rosnącą w strefie klimatu umiarkowanego, o tak wysokiej zawartości diosge­niny, stwarzającą możliwości wykorzystania tego gatunku do produkcji hormonów steroidowych.2. Cel badańGłównym celem badań jest określenie wpływu, zastosowanych w różnych pro­porcjach, regulatorów rozwoju roślin (tj. kwasu 2,4-dichlorofenoksyoctowego (2,4-D), 6-benzyloaminopuryny (6-BAP)) (10) oraz hormonu steroidowego (tj. 17-p-estradiolu (17P-E)) (11) na zawartość diosgeniny w tkance kalusowej Polygonatum verticillatum (L.) Ali. (12) oraz opracowanie metody densytometrycznego oznaczania zawartości diosgeniny w ekstraktach roślinnych.Oznaczenie ilości diosgeniny w tkance kalusowej w hodowli in vitro umożliwi po­równanie jej z zawartością diosgeniny w roślinie rosnącej w stanie naturalnym.3. Materiał i metodyDo analizy wykorzystana została tkanka kalusowa Polygonatum verticillatum (L.) Ali. Tkankę kalusową otrzymano z części hipokotylowej kiełkujących z nasion sie­wek. Nasiona pozyskano ze stanowisk naturalnych kokoryczki okółkowej znajdu­94 PRACE EKSPERYMENTALNEDensytometryczna analiza diosgeniny w ekstraktach z tkanki kalusowej Polygonatum verticillatum (L.) Ali.jących się na obrzeżach aglomeracji krakowskiej, na terenie Tatr i Pienin oraz z ogrodów botanicznych Wrocławia, Warszawy, Berna, Ztirichu, Innsbrucka, Gene­wy i Wiednia.Nasiona odkażano przez mechaniczne oczyszczenie i przepłukanie ich w wodzie redestylowanej, a następnie poddanie chemicznej sterylizacji 70° alkoholem etylo­wym przez 60 sekund w celu odtłuszczenia i odpowietrzenia powierzchni odka­żanej. Umożliwiło to lepszą penetrację właściwego roztworu odkażającego, jako główny środek sterylizujący zastosowano 0,]% roztwór HgCl2 przez 30 minut z do­datkiem zwilżacza zmniejszającego napięcie powierzchniowe w postaci preparatu Tween 20 (roztwór 0,05%). Dezynfekcję kończyło trzykrotne płukanie odkażonych nasion w sterylnej wodzie redestylowanej. Pierwsze płukanie trwało 60 sekund, a następne dwa płukania po 5 minut.W celu indukcji rozwoju tkanki kalusowej z części hipokotylowej siewek, rozwi­jających się z nasion, najlepsze wyniki uzyskiwano stosując stałe podłoże Murashige1 Skooga (MS) zawierające 100 mg/dm^ mezo-inozytolu, 30 g/dm^ sacharozy,2 mg/dm^ 2,4-D i 1 pM/dm^ 17-p-estradiolu, doprowadzone do pH 5,6-5,8, zestalone 0,6% agarem. Podłoże wyjaławiano w autoklawie pod ciśnieniem 0,1 MPa, w tempe­raturze 120°C przez 20 minut. Podczas doświadczenia utrzymywano temperaturę: 22°C (noc) i 26°C (dzień), 16-godzinny fotoperiod (promiennik FLUORA® firmy OSRAM emitujący głównie promieniowanie z niebieskiego i czerwonego obszaru widma) o natężeniu światła około 1500 luksów i 60% względną wilgotność powietrza (13,14). W opisanych warunkach tkanka kalusowa powstająca z hipokotylowej części siewek była możliwa do uzyskania po 7 tygodniach od początku inkubacji nasion.W celu sprawdzenia wpływu regulatorów wzrostu roślin oraz hormonu steroido­wego na zawartość diosgeniny w badanej tkance kalusowej zastosowano 9 warian­tów stałej pożywki MS. Do pożywki dodano odpowiednio: 1/1,2/2, 5/5, 10/10 ([mg/dm^] 2,4-D/[mg/dm3] 6-BAP) oraz 1/1/1, 2/2/2, 5/5/5, 10/10/10 ([mg/dm^] 2,4-D / [pM/dm^j 17-p-estradiolu/[mg/dm^] 6-BAP). Zastosowano także pożywkę MS bez dodatku re­gulatorów wzrostu roślin oraz hormonu steroidowego. Tkankę kalusową (podzie­loną na 3 grupy) pasażowano co 3 tygodnie oraz co 6 tygodni stosując opisany 16-godzinny fotoperiod, a także co 3 tygodnie hodując badaną tkankę w ciemności).Hodowana w ten sposób tkanka kalusowa po 18 miesiącach stanowiła podstawę do dalszej analizy ilościowej.Do analizy densytometrycznej wykorzystano ekstrakty otrzymane z rozdrobnio­nej i przesianej przez sito 1,6 mm tkanki kalusowej. Naważki badanych surowców (0,5 g w 3 próbkach tkanki kalusowej dla każdego z 9 wariantów pożywki MS) zwil­żano wodą destylowaną (pH 6) i inkubowano w cieplarce w temperaturze 40°C przez 24 godziny. Z wilgotnych próbek umieszczonych w kolbkach okrągłodennych po dodaniu 50 ml metanolu ekstrahowano saponozydy w temperaturze wrzenia rozpuszczalnika przez 1 godzinę. Ekstrakcję powtarzano trzykrotnie, a połączone ekstrakty metanolowe zagęszczano do sucha. Do zagęszczonych ekstraktów doda­no po 20 ml 3 M metanolowego roztworu chlorowodoru i prowadzono hydrolizęBIOTECHNOLOGIA 2 (65) 93-99 2004 95Przemysław Szybka-Hrynkiewicz, Zbigniew JaneczkoW temperaturze wrzenia przez 3 godziny. Hydrolizaty rozcieńczano dwukrotnie wodą, odparowywano metanol i wytrząsano pięciokrotnie po 3 minuty w rozdziela­czu z 15 ml eteru etylowego w celu eluowania aglikonów. Warstwa eterowa po od­parowaniu i rozpuszczeniu suchej pozostałości w chloroformie oraz po przeniesie­niu do kolbek miarowych o pojemności 10 ml, została użyta do analizy chromato­graficznej (1).Chromatografię cienkowarstwową (TLC) prowadzono na płytkach firmy Merck (Alu- folien Kieselgel 60 bez wskaźnika fluorescencyjnego, art. nr 1.05553.). Na płytki chro­matograficzne nanoszono aplikatorem LINOMATIV firmy CAMAG (Mutenz - Szwajca­ria) wzorcowy 0,05% chloroformowy roztwór diosgeniny (227 Ih Diosgenin pure KOCH-LIGHT LABORATORIES LTD) w ilości 2 pl oraz od 10 do 30 pl próbek badanych. Chromatogramy rozwijano techniką wstępującą na drodze 10 cm w fazie ruchomej: n-heksan : aceton (4 : 2) w komorze chromatograficznej firmy Merck (22 x 12 x 4 cm). Po rozwinięciu suszono strumieniem powietrza, spryskiwano 16% wodnym roz­tworem kwasu siarkowego i ogrzewano w temperaturze 100-105°C przez 2 minuty.Analizy wykonywano na densytometrze firmy CAMAG (Mutenz - Szwajcaria) przy długości fali X = 500 nm.4. Wyniki i dyskusjaWyniki eksperymentów można podsumować w następujących punktach:1) opracowano skuteczną metodę dezynfekcji nasion; kiełkowało średnio 34% z wysianych nasion, inkubowanych w temperaturze 26°C,2) dzięki zastosowaniu podłoża MS z dodatkiem 2 mg/dm^ 2,4-D i 1 pM/dm^ 17-p-estradiolu uzyskano tkankę kalusową z hipokotylowej części siewek,3) zoptymalizowano metodę przygotowywania ekstraktów z materiału roślinne­go służących do późniejszej analizy ilościowej poprzez zwielokrotnienie procesu eluowania aglikonów, co w efekcie dało zwiększenie wydajności pozyskiwania dios­geniny z surowca, w porównaniu do metody zastosowanej w pracy (1),4) opracowano densytometryczną metodę oznaczania diosgeniny w ekstraktach z tkanki kalusowej Polygonatum verticillatum (L.) Alk,5) przy zastosowaniu płytek chromatograficznych pokrytych żelem krzemionko­wym 60 i fazy ruchomej: n-heksan : aceton (4 : 2) uzyskano dobry rozdział związków umożliwiający densytometryczne oznaczenie diosgeniny,6) dla poszczególnych plam związków zarejestrowano widma absorpcji w zakre­sie 350-600 nm i ustalono analityczną długość fali dla diosgeniny przy X = 500 nm,7) oznaczono procentową zawartość diosgeniny w badanych próbkach (tab.),8) w analizie uzyskanych wyników stwierdzono, że zastosowaną metodę cechuje czułość rzędu 5 x 10'^ mg x ml ^9) wyznaczona krzywa kalibracji zachowuje liniowość w szerokim zakresie stę­żeń od 0,5 [mg X ml'^1 x 10'^ do 40 [mg X mf’| x lO"^ (rys.).96 PRACE EKSPERYMENTALNEDensytometryczna analiza diosgeniny w ekstraktach z tkanki kalusowej Polygonałum verticillatum (L.) Ali.10) W ustalonych warunkach uzyskano powtarzalne wyniki. Mieszczą się one w granicach od 0,0642 do 1,1458%.TabelaZawartość diosgeniny w próbkach tkanki kalusowej Polygonatum verticillatum (L.) Ali. uzyskanych na różnych wariantach pożywki MSDodatki do pożywki MS Średnia arytm. zawart. diosg.X [%]OdchyleniestandardoweSWspółczynnikzmiennościV2,4-D[mg/dm5]17p-E[|iM/dm^]6-BAP[mg/dm3]- - - 0,1590 0,000204 12,84761 - 1 0,1670 0,000131 7,8504-a1 1 1 0,0642 7,15E-05 11,1492oac 2 - 2 0,1629 4,51E-05 2,7665O 2 2 2 0,1168 9,91E-05 8,4836s5 - 5 0,1875 0,000105 5,58815 5 5 0,1515 6,43E-05 4,246010 - 10 0,1353 0,000151 11,136710 10 10 0,2524 0,000169 6,7079- - - 0,2154 0,000154 7,16651 - 1 0,2121 9.91E-05 4,67041 1 1 0,1374 0,00011 7,9994"o2 - 2 0,2644 0,000143 5,42032 2 2 0,1203 0,000192 15,93945 - 5 0,2095 0,000172 8,19675 5 5 0,2217 8,18E-05 3,687910 - 10 0,1952 0,000198 10,119610 10 10 0,1982 0,000197 9,9527*G - - - 0,1487 0,0001.38 9,26431 - 1 0,1276 0,000113 8,88411 1 1 0,6465 0,000439 6,78332 - 2 1,1458 0,000832 7,2583c 2 2 2 0,5122 0,000257 5,0219&5 - 5 0,1834 0,000159 8,64585 5 5 0,1434 0,000151 10,5595•rsj 10 - 10 0,8850 0,000753 8,5125O. 10 10 10 0,1541 0,000123 7,9868średnia arytmetyczna z oznaczeń x = 0,26.36%, odchylenie standardowe średniej arytmetycznej — 0,002495%, przedział ufności średniej arytmetycznej dla przyjętego prawdopodobieństwa 95% (a = 0,05) wynosi od 0,2626 do 0,2646%;Tl = 0,2636 ± 0,001).BIOTECHNOLOGIA 2 (65) 93-99 2004 97Przemysław Szybka-Hrynkiewicz, Zbigniew Janeczkodiosgeninay = 378,28 + 375,75 x xy10Rys. 1. Krzywa kalibracji.20 30 40Regresja 95% p. ufnościC [mg ml ^] 10^Informacje dotyczące wpływu 17-p-estradiolu na procesy fizjologiczne roślin przedstawione w (9) stanowiły przesłankę do podjęcia badań wpływu tego związku na zawartość w niej diosgeniny. Wyniki badań przedstawione w tabeli wskazują, że wpływ 17-p-estradiolu nie ma istotnego znaczenia na zawartość diosgeniny. Jedyne odstępstwo można było zaobserwować w tkance kalusowej pasażowanej co 6 tygod­ni po dodaniu dużej ilości (10 pM/ dm^) tego związku, ale również w tej samej prób­ce dodano po 10 mg/dm^ 2,4-D oraz 6-BAP. W tej sytuacji przedwczesne byłoby stwierdzenie, że przyrost ten jest skutkiem dodania 17-p-estradiolu.Natomiast oceniając wpływ związku 6-BAP, który dodawany łącznie ze związ­kiem 2,4-D w jednakowych ilościach w sposób nieznaczny, ale widoczny wykazuje dodatnią korelację z zawartością procentową diosgeniny w badanej tkance pasa­żowanej co 3 i co 6 tygodni, w warunkach 16-godzinnego fotoperiodu. Uwagi te do­tyczą uśrednionych wartości wyników procentowej zawartości diosgeniny (dla tych samych ilości dodawanych związków: 6-BAP i 2,4-D). Eksperyment przeprowadzony na tkance pasażowanej co 3 tygodnie, hodowanej w warunkach braku dostępu światła nie potwierdza ww. oceny.5. Wnioski1. Stwierdzono korzystny wpływ 6-benzyloaminopuryny (6-BAP) oraz kwasu 2,4-dichlorofenoksyoctowego (2,4-D) na zawartość diosgeniny w tkance kalusowej.98 PRACE EKSPERYMENTALNEDensytometryczna analiza diosgeniny w ekstraktach z tkanki kalusowej Polygonatum verticillatum (L.) Ali.2. Właściwie dobrane warunki oznaczania pozwalają uzyskać zadowalającą po­wtarzalność wyników, a metodę cechuje szeroki zakres liniowości, czułość rzędu 5 X 10'^ mg X ml ' oraz krótki czas wykonywania oznaczenia (około 1 godz.).3. Opracowana metoda analizy densytometrycznej może być wykorzystana do ilościowego oznaczania diosgeniny w ekstraktach z materiału roślinnego pocho­dzącego zarówno z hodowli sztucznej, jak i ze stanowisk naturalnych.Literatura1. Janeczko Z., (1993), Badania nad saponozydami steroidowymi krajowych gatunków w rodzaju Polygonatum Ali., rozprawa habilitacyjna. Akademia Medyczna, Kraków.2. Fazii F. R., (1968), Pak jSCI 20 (1 and 2), 64-67.3. Janik I., Janeczko Z., (1995), Farmacja Polska, 51 (12), 518-527.4. Furmanowa M., Guzewska J., (1988), Ed. Y. P. S. Bajaj, Biotechnology in Agriculture and Forestry 7, Me­dicinal and Aromatic Plants II, Springer, Berlin, 162-184.Savikin-Fodulovic K., Grubiśić D., Ćtilafić L., Menkovic N., Ristic M., (1998), Plant Science, 135, 63-67.Nowak A., Krajewska A., (1982), Flerba Polonica, 28, 75.Furmanowa, M., Guzewska J., Betdowska B., Rzędowski M., (1985), Flerba Polonica, 31(3-4), 155-166.Sibiga A., Sendra J., (1983), Streszczenia Ref. XII Nauk. Zjazdu Pol. Tow. Farm., Kraków.Mirek Z., Piękoś-Mirek H., Zając A., Zając M., (1995), Vascular Plants of Poland a Checklist, Wyd. Inst. Botaniki PAN, Kraków.10. Jankiewicz L. S., (1997), Regulatory wzrostu i rozwoju roślin, PWN, Warszawa.11. Janeczko A., (2000), Wpływ wybranych steroidów na procesy fizjologiczne roślin ze szczególnym uwzględ­nieniem indukcji kwitnienia, praca doktorska. Akademia Rolnicza, Kraków.12. Nowak A., Krajewska A., Dedio 1., (1980), Flerba Polonica, 26, 1.13. Chmiel A., (1992), Biotechnologia, 4 (19), 5-16.14. Sengupta J., Sen S., (1987), Current Science, 56 (24), 1287-1289.BIOTECHNOLOGIA 2 (65) 93-99 2004 99

Densitometric analysis of diosgenin in extracts from callus tissue of Polygonatum verticillatum (L.) All.

https://ruj.uj.edu.pl/xmlui/bitstream/handle/item/251046/szybka-hrynkiewicz_janeczko_densytometryczna_analiza_diosgeniny_w_ekstraktach_2004.pdf?sequence=1&isAllowed=y

Densitometric analysis of diosgenin in extracts from callus tissue of Polygonatum verticillatum (L.) All.

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Jagiellonian Univeristy Repository