Influence of TNF-α on proinflammatory cytokine production in WM266.4 melanoma cells with decreased RIPK4 level

Abstract

Stan zapalny stanowi mechanizm obronny organizmu, którego zadaniem jest neutralizacja czynników uszkadzających i przywrócenie homeostazy. Przewlekłe utrzymywanie się tego procesu jest stanem patologicznym sprzyjającym rozwojowi wielu chorób. Chroniczny stan zapalny przyczynia się między innymi do powstawania i progresji nowotworów, w tym czerniaka. Czerniak złośliwy jest nowotworem skóry wywodzącym się z melanocytów. Obecność w jego mikrośrodowisku toczącego się stanu zapalnego i zdolność do autokrynnego podtrzymywania tego procesu przez produkcję cytokin takich jak TNF-α wspomaga wzrost i migrację komórek guza. Identyfikacja markerów biologicznych zaangażowanych w szlaki sygnalizacyjne biorące udział w regulacji odpowiedzi zapalnej może przyczynić się do opracowania nowych metod leczenia i terapii celowanych przeciwko czerniakowi. Jednym z takich markerów może być oddziałująca z receptorem kinaza serynowo-treoninowo-białkowa 4 (RIPK4), której zaangażowanie w regulację stanu zapalnego wykazano w przypadku raka trzustki oraz prawidłowych keratynocytów.Celem niniejszej pracy było zbadanie czy obniżenie poziomu kinazy RIPK4 wpływa na produkcję cytokin prozapalnych indukowanych TNF-α przez komórki czerniaka linii WM266.4. W pracy wykorzystano technikę obniżenia ekspresji genu poprzez transfekcję siRNA, odwrotną transkrypcję i PCR w czasie rzeczywistym oraz test immunoenzymatyczny ELISA. Przeprowadzono również analizę transkryptomu i zmian ekspresji genów wykorzystując sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) i zasoby baz danych KEGG, Gene Ontology, UniProt, STRING oraz GeneMANIA. Wykazano, że pod wpływem TNF-α w komórkach WM266.4 zwiększa się poziom transkryptu dla IL-8. Transfekcja siRNA skutecznie obniża ekspresję RIPK4, co skutkuje obniżeniem poziomu transkryptu IL-8 w warunkach stymulacji TNF-α, jednakże wynik testu ELISA nie pokazuje korelującej zmiany w poziomie białka tej cytokiny. Analiza NGS wykazała wpływ RIPK4 na regulację szlaków sygnalizacyjnych NF-κB, MAPK i JAK-STAT, które są zaangażowane w kontrolę stanu zapalnego. Otrzymane dane wskazują na znaczącą rolę kinazy RIPK4 w procesie regulacji stanu zapalnego w komórkach czerniaka i jej potencjał jako cel molekularny w terapiach celowanych.Inflammation is the body’s defence mechanism, which ensures homeostasis restoration and protection from harmful stimuli. Prolonged inflammation is a pathological process and may lead to development of many diseases such as cancer, including melanoma. Malignant melanoma is a type of skin cancer which originates from melanocytes. The presence of ongoing inflammation in the microenvironment of the tumour and its ability to maintain the process by autocrine regulation and production of cytokines such as TNF-α provides a favourable conditions for cells’ growth and migration. Identifying biological markers involved in signalling pathways regulating inflammatory response may contribute to the development of new forms of melanoma treatment and targeted therapies. The role of receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 4 (RIPK4) in the control of inflammatory process has been studied and described in pancreatic cancer as well as in normal keratynocyte cells.Presented study aims to investigate whether silencing of RIPK4 gene inpacts the cytokine production in WM266.4 melanoma cell line treated with TNF-α. The gene silencing was performed using siRNA transfection method. Reverse transcription, real time PCR and ELISA test were used to determine cytokine transcript and protein levels. Whole transcriptome analysis was performed using new generation sequencing (NGS) method and database resources from KEGG, GeneOntology, UniProt, STRING and GeneMANIA. This study has shown that treating WM266.4 cells with TNF-α results in higher IL-8 transcript level. siRNA transfection effectively reduces RIPK4 level and in consequence reduces IL-8 transcript level in TNF-α stimulated cells. However the ELISA test result did not show correlating change in cytokine protein level. NGS analysis has shown the effect of RIPK4 expression on inflammation regulating pathways such as NF-κB, MAPK and JAK-STAT pathway. The obtained data shows that RIPK4 is involved in the regulation of inflammatory response in melanoma cells which makes the kinase a potential biological marker for targeted therapies