Studies of intercellular interactions using synthetic Notch receptors

Abstract

Prawidłowe funkcjonowanie organizmu wielokomórkowego jest zależne od licznych interakcji pomiędzy poszczególnymi komórkami. Szczególnie istotne dla komórek są odziaływania z ich specyficznym mikrośrodowiskiem, tzw. niszą. Obecnie precyzyjne badanie oddziaływań komórkowych, zwłaszcza między populacjami rzadkich komórek a ich niszą w warunkach in vivo jest mocno ograniczone. W niniejszej pracy proponujemy i sprawdzamy czy można w tym celu zastosować syntetyczne receptory Notch. Celem pracy było zbadanie skuteczności oraz specyficzności systemu SynNotch w warunkach in vitro, tak aby w przyszłość można było go zastosować do badań interakcji komórkowych w warunkach in vivo. W celu stworzenia systemu SynNotch wykorzystano plazmidy: UAS-BFP-PGK-mCherry, eGFP-ligand oraz Lag17-SynNotch-Gal4VP64, które wykorzystano do wyprodukowania wektorów lentiwirusowych. Wyprodukowane wektory zostały zagęszczone dzięki wirowaniu przy wysokim współczynniku wirowania g. Otrzymane miana wektorów lentiwirusowych wyniosły rzędu 109 wirusów/ml. Wektory lentiwirusowe zostały następnie użyte do transdukcji komórek HEK 293T, HMEC-1, CT- 26, w celu ekspresji systemu SynNotch w komórkach. Zastosowany system składał się z receptora SynNotch, który rozpoznaje białko GFP i indukuje ekspresję białka fluorescencyjnego. Komórki, w których ekspresji miał ulegać system SynNotch transdukowano początkowo wektorem UAS- BFP-PGK-mCherry, zawierającym kasetę reporterową. Następnie transdukowane komórki odsortowano, a otrzymywaną stabilnie zmodyfikowaną linię komórkową transdukowano kolejno wektorem z receptorem SynNotch, Lag17-SynNotch Gal4VP64. Komórki, w których ekspresji miał ulegać ligand dla syntetycznego receptora SynNotch, transdukowano wektorem eGFP ligand. Finalnie, otrzymane linie komórkowe odsortowano, tak aby zawierały jedynie stabilnie stransdukowane komórki. Następnie zmodyfikowane linie komórkowe zostały wykorzystane do przeprowadzenia właściwych eksperymentów. W eksperymentach hodowano komórki w kokulturze, z różnym stosunkiem komórek z ligandem do komórek z receptorem SynNotch. Do oceny działania systemu SynNotch wykorzystano techniki: mikroskopii fluorescencyjnej, mikroskopii konfokalnej oraz cytometrii przepływowej.Podsumowując przeprowadzone doświadczenia potwierdzają możliwość zastosowania syntetycznych receptorów Notch do identyfikacji i izolacji oddziałujących ze sobą komórek.The proper functioning of the multicellular organism depends on interactions occurring between cells. Especially important are interactions between cells and their specific microenvironment, referred to as niche. Currently, studing the interactions between individual cells, especially between rare population of cells and their niches in vivo is technically limtited. Here we propose and test the synthetic Notch receptors as a tool for this purpose. The aim of this study was to investigate the efficacy and specificity of the SynNotch platform in vitro. SynNotch platform could be used in the future to study cellular interaction in vivo.To create the SynNotch platform we used plasmids: UAS-BFP-PGK-mCherry, eGFP ligand and Lag17 SynNotch Gal4VP64. These plasmids were used to produce lentiviral vectors. The production of vectors include step of their concentration by ultra-centrifugation. The titer of the obtained lentiviral vectors was of the order 109 viruses/ml. The constructed lentiviral vectors were then used to transduce HEK 293T, HMEC-1 and CT-26 cells to express the SynNotch platform in the cells. The system we used consists of the receptor the recognized extracellular GFP and induces the expression of fluorescent marker. The cells expressing the SynNotch platform were transduced initially with the UAS-BFP-PGK-mCherry vector (reporter cassete). Then the cells were sorted and the modified cell line was subsequently transduced with the Lag17-SynNotch-Gal4VP64 vector with receptor. The cells with ligand were transduced with the eGFP ligand vector. At the end, the modified cell lines were sorted to contained only stably transduced cells.Then the modified cell lines were used to the appropriate experiments. In the experiments, we co-culutred cells with GFP-ligand and cells with the SynNotch receptor at different ratios The following techniques were used to measure the activity of the SynNotch platform: fluorescence microscopy, confocal microscopy and flow cytometry.In summary, the experiments based on synthetic Notch receptors give positive results on the activity and specificity of SynNotch receptors