Analysis of changes in the EPR spectra of TEMPOL as a tool in studying viscosity and effect of macromolecular crowding in solution

Abstract

Wysokie stężenie makromolekuł w komórkach żywych całkowicie zmienia środowisko reakcji biochemicznych tam zachodzących. To zjawisko, nazywane zatłoczeniem makromolekularnym, ma niebagatelne znaczenie na szybkość i wydajność reakcji enzymatycznych. Często używanym parametrem fenomenologicznym służącym do ilościowego opisu tego zjawiska jest lepkość, która, wyznaczana za pomocą standardowych wiskozymetrów, charakteryzuje jedynie własności badanego roztworu na poziomie makroskopowym. Chcąc uzyskać dostęp do informacji o zjawiskach zachodzących na poziomie molekularnym, w środowisku zatłoczonym wymagane jest zastosowanie sondy o rozmiarach porównywalnych z rozmiarami makrocząsteczek w roztworze. W niniejszejpracy wykorzystano sondę spinową TEMPOL, której kształt widma EPR zależy od jej czasu korelacji rotacyjnej. Wielkość ta uzależniona jest od lepkości roztworu na poziomie mikroskopowym zwanej dalej mikrolepkością. W celu analizy mikrolepkości stworzono program służący do symulacji widm EPR nitroksylowej sondy spinowej oraz optymalizacji parametrów w celu uzyskania wartości czasu korelacji rotacyjnej. Na podstawie wykonanych pomiarów TEMPOLu w roztworach glikolu polietylenowego oraz Ficollu wykazano, że lepkość makroskopowa nie zawsze jest tożsama z mikrolepkością, w szczególności dla cząsteczek substancji crowdingowych o dużych rozmiarach. Niniejsza praca pozwala lepiej zrozumieć fizyczne przyczyny efektów towarzyszących zjawisku zatłoczenia makromolekularnego i stanowi metodologiczną podstawę do dalszych badań nad tym zjawiskiem w układach biologicznych.High concentration of macromolecules in living cells causes changes in the enviroment of biochemical processes. That effect, called macromolecular crowding, has significant role in reaction rate of enzymatic reactions. Viscosity, determined by glass viscometers, is a parameter often used to quantitatively describe macromolecular crowding. However, viscosity characterizes only macroscopic properties of analysed solution. The usage of molecular probe with similar properties to those of macromolecules in solution is required in order to gain access to the information related to microscale phenomena. In this paper TEMPOL spin probe was used to determine its rotational correlation time, which heavily influences EPR spectrum. Correlation time is related to microscopic viscosity of solution, which will be referred to simply as microviscosity.I developed a program which allows us to simulate EPR spectra of nitroxide radicals in solution and fit parameters in order to obtain rotational correlation time. Based on the conducted measurements of TEMPOL in polyethylene glycol and Ficoll, it was shown that macroscopic viscosity is not always equal to microviscosity, especially when it comes to large molecules of crowding reagents. The purpose of the present study is to better understand physical causes of effects accompanying macromolecular crowding. This paper establishes a methodological support in future research of macromolecular crowding in biological systems