The contribution of oxygen metabolism to the inflammatory response of murine RAW 264.7 macrophages

Abstract

Makrofagi to jedne z najważniejszych komórek uczestniczących w pierwszej linii obrony organizmu przed patogenami, a przemiany biochemiczne zachodzące w tych komórkach mogą mieć znaczenie dla ich funkcji obronnych. Ponadto komórki te w określonym mikrośrodowisku mogą reprezentować dwa odmienne fenotypy, funkcjonować jako makrofagi aktywowane klasycznie (M1) lub aktywowane alternatywnie (M2). W makrofagach M1, po ich aktywacji, obserwujemy przejście metaboliczne w kierunku glikolizy tlenowej, którą można porównać do „efektu Warburga” występującego w komórkach nowotworowych. Celem pracy było określenie wpływu zahamowania syntazy ATP na przebieg procesu zapalnego indukowanego w linii komórkowej makrofagów mysich, poprzez oznaczenie poziomu tlenku azotu, ocenę żywotności oraz poziomu (całościowego) produkowanego białka. Badania przeprowadzono na linii komórkowej makrofagów mysich RAW 264.7, które traktowano oligomycyną (inhibitor syntazy ATP) w różnych stężeniach, dodatkowo część komórek stymulowano lipopolisacharydem (LPS) w stężeniu 10 μg/ml. Grupę kontrolną stanowiły komórki nietraktowane oligomycyną i niestymulowane LPS. Wpływ zahamowania syntazy ATP na poziom wydzielonego tlenku azotu określono przy użyciu metody Griess’a, a poziom (całościowego) białka za pomocą testu BCA. Ocenę żywotności przeprowadzono wykorzystując testy MTT oraz PrestoBlue. Uzyskane wyniki wskazują, że oligomycyna w najniższym wykorzystanym stężeniu powoduje obniżenie poziomu wydzielanego tlenku azotu. Nie wykazano natomiast zmian w aktywności dehydrogenaz mitochondrialnych (test MTT) w obecności oligomycyny, nie wpłynęła ona także na wydzielanie białek. Z kolei wyniki testu PrestoBlue wykazały wzrost żywotności komórek stymulowanych LPS. Przyszłe badania powinny być poszerzone o określenie poziomu wybranych, konkretnych białek pro- i przeciwzapalnych.Macrophages are one of the most important cell types participating in the body's first line of defense against pathogens, and biochemical processes taking place in these cells may have an impact on their defense functions. The cells display one of two major phenotypes depending of microenvironment, being either classically activated (M1) or alternatively activated (M2). In M1 macrophages, after activation, metabolic transition towards oxygen glycolysis occurs which can be compared to the "Warburg effect" in cancer cells. The aim of the study was to determine the effect of inhibition of ATP synthase on the course of the inflammatory process in murine macrophages by determining the level of nitric oxide, assessment of cell viability and the level (total) of proteins released by macrophages. The studies were carried out on the RAW 264.7 murine macrophage cell line which was treated with various concentrations of oligomycin (ATP synthase inhibitor). In addition, some of the cells were stimulated with lipopolysaccharide (LPS) at a concentration of 10 μg/ml. The control group consisted of cells untreated with oligomycin and non-stimulated with LPS. The effect of ATP synthase inhibition on the level of secreted nitric oxide was determined using the Griess test and the level of (total) protein was measured by the BCA test. Viability assessment was carried out using the MTT and PrestoBlue tests. The obtained results indicate that oligomycin in the lowest concentration used causes a decrease in the level of nitric oxide. Activity of mitochondrial dehydrogenases (the MTT test) showed no effect of oligomycin on cell viability, a similar effect was observed in the case of released proteins. The results of the PrestoBlue test showed an increase in the viability of cells stimulated with LPS when compared to non-stimulated with LPS. Future studies should concentrate on more detailed evaluation of proteins released by macrophages, namely exemplary pro- and anti-inflammatory proteins