The role of the N-terminal helix of G-protein alpha subunit in recognition of plasma membrane lipids

Abstract

Heterotimeryczne Białka G pełnią ważną rolę w przekazywaniu sygnałów. Zbudowane są z podjednostek α, β, ɣ. Interakcja z błoną komórkową podjednostki α pełni ważna rolę w przekazywaniu sygnału. Jednymi z podjednostek α są Gαi1 hamujące cyklazę adenylową oraz Gαsl stymulujące cyklazę adenylową. Według badań dla podjednostek α do interakcji z błoną istotne są kotwice zbudowane z kwasów tłuszczowych oraz N-końcowa α helisa, która zawiera dodatnio naładowane reszty aminokwasowe. W czasie badań za pomocą narzędzi biologii molekularnej stworzono hybrydę Gαsl i Gαi1 z zamienioną N-końcowa α helisą Gαsl na Gαi1. Białko nie posiadało kotwic lipidowych, ponieważ było produkowane w E.coli. Następnie oczyszczono białko i wykonano liposomy zbudowane z różnych lipidów. Sprawdzono specyficzność względem lipidów hybrydy oraz czy inny obszar odpowiada za oddziaływanie białko-lipid. Doświadczenie przeprowadzono w dwóch różnych buforach, w celu sprawdzenia wpływu siły jonowej. Wyniki analiz dot-blot pokazały, że hydryda wiąże się specyficznie do błony zbudowanej z nasyconych lipidów oraz, że więcej frakcji było związane w buforze o mniejszej sile jonowej. Hybryda wykazywała cechy wiązania charakterystyczne zarówno dla podjednostki Gαi1 jak i Gαsl, co sugeruję, że w oddziaływaniu brała udział też inna cześć białka niż N-końcowa helisa. Do lepszego określenia interakcji potrzebne są dalsze badania ilościowe.Heterotrimeric G proteins are critical for cellular signaling. They are composed of α, β and ɣ subunits. Interaction α subunit-plasma membrane is crucial for signal transduction. Among Gα are Gαi1 (inhibition of adenylyl cyclase) and Gαsl (stimulation of adenylyl cyclase), which were taken into account during studies. According to a previous study presence of lipids anchors is essential for lipid-Gα subunit interaction. N-terminus helix with positively charged residues is also crucial for the interaction with the plasma membrane. In this studies, molecular biology tools and techniques were used to swap N-terminus helix Gαsl to Gαi1. The hybrid was produced in E.coli, therefore, it didn’t have lipids anchors. Then the recombinant protein was purified and liposomes (model membrane) were prepared from different lipids. The aim of the experiment was analysis of binding preferences of recombinant protein to lipids and determining another binding region within protein associated with binding to lipids. The experiments were conducted in two different buffers to check the impact of ionic strength. The dot-blot result showed that the hybrid has the preference to bind membrane with saturated chains, larger amounts of protein were bound in buffer with lower ionic strength. The hybrid has features of Gαi1 and Gαsl subunits. The result showed that the N-terminus helix and another region of the hybrid are responsible for protein-lipids interaction. Further research is needed for better determining of the hybrid-lipids interaction