The role of Wnt-5a in cervical carcinoma

Abstract

Rak szyjki macicy jest trzecim, po raku płuc i piersi, najczęściej występującym nowotworem wśród kobiet na świecie. Obecnie, jako główny czynnik etiologiczny uważa się wirus brodawczaka ludzkiego (HPV). Jednak, jako że tylko niewielka część zainfekowanych komórek ulega transformacji nowotworowej, poszukuje się innych mechanizmów leżących u podłoży nowotworzenia. Wiadomo, iż aktywacja receptora MET, obecnego w dużej ilości na komórkach nowotworowych, przez czynnik wzrostu hepatocytów (HGF) prowadzi do indukcji przejścia epitelialno – mezenchymalnego i tym samym nadaje komórkom cech inwazyjnych. Okazało się jednak, że czynnik ten nie jest wystarczający do zapoczątkowania przerzutowania w początkowych stadiach nowotworu. Drugim niezbędnym składnikiem okazał się Wnt-5a.W eksperymentach została użyta linia komórkowa raka szyjki macicy C-4I.Komórki stymulowano czynnikami, HGF, Wnt-5a lub HGF i Wnt-5a jednocześnie. Po 96 godzinnej inkubacji, określano profile ekspresji genów na poziomie transkryptu za pomocą PCR w czasie rzeczywistym i na poziomie białka za pomocą metody Western Blot. Zdolność do migracji i inwazyjność określono poprzez test zarastania rany i test chemotaksji z użyciem insertów. Zauważono, że synergistyczny efekt HGF i Wnt-5a wpływa na ekspresję markerów charakterystycznych dla przejścia EMT. Zaobserwowano spadek E-kadheryn, i wzrost wimentyn, charakterystyczny dla nabywania cech komórek mezenchymalnych. Sprawdzono również ekspresją białek: SNAIL, SLUG, MMP-1. Kolejne doświadczenia pokazały, że sam Wnt-5a nie wpływa na nabywanie przez komórki zdolności do nieukierunkowanego ruchu. Okazało się, że Wnt-5a jest ważnym czynnikiem chemotaktycznym. Wnt-5a razem z HGF umożliwiały komórkom migrację przez inserty do chemoatraktantów. W obecności HGF komórki nabywały zdolności migracyjnych, ale to Wnt-5a indukował zdolność do ukierunkowanego ruchu. Podsumowując, otrzymane wyniki świadczą o udziale obu białek w procesach nowotworzenia. Stymulacja komórek z HGF i Wnt-5a skutkuje procesami charakterystycznymi dla przejścia epitelialno - mezenchymalnego.Cervical cancer is the third, after lung and breast cancer, leading cause of cancer death among women in Poland. The main etiological factor is human papilloma virus (HPV). It is confirmed that activation of MET receptor by hepatocyte grow factor (HGF) induces epithelial to mesenchymal EMT transition, resulting in tumor cells invasion and metastasis. Previous experiments showed that HGF/MET axis was fully responsible for inducing morphological changes in cervical cancer cells in vitro, however, HGF stimulation was insufficient to enable scattering of cells in early stages of cervical cancer. As investigated, the second factor necessary for cancer metastatic progression was Wnt-5a protein.The aim of this work was to investigate the Wnt5a and HGF influence on C4-I cells which correspond with early stages of cervical cancer. The cells was stimulated for 96 hours with factors: Wnt-5a, HGF or with both of them. We examined the expression of various proteins characteristic for EMT such as: SNAIL, SLUG, vimentin, E-cadherin. We use Real Time PCR and Western Blot for evaluated expression of genes typical for EMT. We also analyze invasion and migration ability by scratch assay and chemotaxis assay. We determined that synergistic effect of Wnt-5a and HGF was crucial for increased Vimentin level and decrease E-cadherin level during epithelial to mesenchymal transition. Also differences in expression of SLUG, SNAIL, MMP-1 was revealed. After stimulation with HGF and Wnt5a changes in protein and RNA expression were typical for EMT. Other experiments show that Wnt-5a does not enhance migratory ability. HGF allow scattering cells and they acquire the capability to invade. It is turned out that Wnt-5a is important chemotactic factor. Wnt-5a together with HGF enable migration of cells, but HGF responds mainly for motility and Wnt-5a is the major chemoattractant.Summarizing, Wnt5a plays important role in cancer invasion and metastasis. This factor, together with HGF, is responsible for implementation of epithelial to mesenchymal transition in cervical cancer