Characterizing of PHR2, a putative photolyase/blue-light photoreceptor from Arabidopsis thaliana and investigation of this protein interaction partners

Abstract

Promieniowanie ultrafioletowe, w szczególności UV-B o długości fali 280 – 320 nm, indukuje powstawanie genotoksycznych fotoproduktów w DNA. Dwa główne typy uszkodzeń wywołanych przez UV to cyklobutanowe dimery pirymidyny (CPDs) i fotoprodukty 6-4 pirymidyno-pirymidynowe (6-4 PPs). U roślin wyższych występują różne strategie umożliwiające minimalizację uszkodzeń wywołanych promieniowaniem UV. Jednym z takich mechanizmów jest fotoreaktywacja, czyli zależna od światła niebieskiego i UVA enzymatyczna naprawa dimerów. Fotoreaktywacja polega na katalitycznej hydrolizie wiązania kowalencyjnego między dimerami pirymidynowymi i prowadzona jest przez enzymy zwane fotoliazami. Niniejsza praca poświęcona była wstępnej charakterystyce białka PHR2 Arabidopsis thaliana. Na podstawie analizy in silico PHR2 jest opisywane jako fotoliaza/fotoreceptor światła niebieskiego. W wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych (ang. high throughput screening) z wykorzystaniem drożdżowych testów dwuhybrydowych wykazano, że PHR2 może wchodzić w interakcje z niektórymi białkami biorącymi udział w regulacji szlaków przekazu sygnału takimi jak: ATARCA, AGB1 oraz RGS1, a także z białkiem At5g57170, o niepoznanej dotąd funkcji. Głównym celem pracy było zweryfikowanie powyższych oddziaływań wykorzystując w tym celu dwucząsteczkową komplementację fluorescencji oraz drożdżowy system dwuhybrydowy. Dodatkowo sprawdzano aktywność fotoliazową PHR2, stosując test komplementacji z użyciem bakterii pozbawionych naturalnej fotoliazy, a także badano ekspresję genu kodującego powyższe białko przy pomocy metody PCR w czasie rzeczywistym. Wykazano, że białko PHR2 uzupełnia, w sposób zależny od światła, niedobór naturalnej fotoliazy w naświetlanych UVB bakteriach E. coli, co wskazuje na jego potencjalną aktywność fotoliazową. Względny poziom ekspresji genu PHR2 jest różny w zależności od organu A. thaliana oraz etapu rozwoju rośliny. Najwyższy poziom ekspresji zaobserwowano w siewkach Arabidopsis, najniższy w korzeniach dorosłych roślin. Dodatkowo wykazano, że światło białe pozytywnie reguluje poziom mRNA PHR2. Stosując transfomację przejściową N. benthamiana pokazano, że PHR2 lokalizuje się w jądrze i chloroplastach, sprawdzono także lokalizację wewnątrzkomórkową wszystkich badanych potencjalnych partnerów PHR2. Potwierdzono również zachodzenie oddziaływań pomiędzy PHR2 a At5g57170.Ultraviolet radiation, especially UV-B which have spectrum from 280 nm to 320 nm, induces formation of genotoxic photoproducts in DNA. The two major lesions in DNA induced by UV are cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs) and 6-4 photoproducts (6-4 PPs). In higher plants several strategies to repair different types of UV-induced damage exist. One of this strategies is a light-dependent process called photoreactivation catalyzed by photolyases. Photoreactivation is an enzymatic repair, which allows catalytic hydrolysis of the covalent bond between the pyrimidine dimers. This work was dedicated to preliminary characteristics of PHR2 protein from Arabidopsis thaliana. Based on in silico analysis this protein is postulated to act as a photolyase and/or blue-light photoreceptor. Some proteins have been shown to interact with PHR2 using high throughput screening assays. These proteins are: ATARCA, RGS1, AGB1 which are involved in signal transduction pathways: and At5g57170, a protein with unknown function. To verify the interactions yeast two-hybrid system and bimolecular fluorescence complementation were used. Moreover, a photolyase complementation assay in E. coli has been performed. Another aim of this work was to check the PHR2 expression in different organs of Arabidopsis as well as influence of light on this gene expression using real-time PCR. It was shown that PHR2 protein complement a photolyase-deficient mutant of Escherichia coli in a light dependent manner. However, a photoreactivation activity of this protein still needs to be confirmed. The relative PHR2 expression varied between Arabidopsis organs and different life stages. The highest mRNA level of this gene was observed in seedlings, the lowest in mature roots. The expression of PHR2 gene was up-regulated by white light. It was shown that PHR2 is located in chloroplasts and nucleus. The subcellular localization of all proteins which potentially interact with PHR2 was also checked. Only an interaction between PHR2 and At5g57170 was confirmed