Effects of transforming growth factor β on differentiation of C2C12 cell line myoblasts in vitro.

Abstract

Fuzja mioblastów jest procesem niezbędnym dla wzrostu mięśni w trakcie rozwoju osobniczego jak i regeneracji włókien mięśniowych następującej po ich uszkodzeniu. W różnicowanie i naprawę mięśnia zaangażowane są różnorakie ścieżki sygnałowe, których zakłócenie może prowadzić do licznych patologii, jak na przykład włóknienie. Włóknienie jest procesem polegającym na nadmiernym wydzielaniu przez komórki miofibroblastyczne komponentów macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), głównie kolagenów, i tym samym na uszkodzeniu struktury i funkcji danej tkanki lub organu. W przypadku fibrozy mięśni, mioblasty zamiast fuzjować ze sobą lub sąsiadującymi włóknami mięśniowymi przyjmują fenotyp miofibroblastyczny i rozpoczynają wzmożoną ekspresję białek macierzy zewnątrzkomórkowej. Najistotniejszą cytokiną związaną z przebiegiem włóknienia, a także powstawaniem blizn, wydaje się być transformujący czynnik wzrostu β (TGFβ). Jest on wydzielany w miejscu uszkodzenia przez wiele typów komórek, w tym limfocyty, płytki krwi, fibroblasty i reguluje przebieg procesu gojenia.Celem niniejszej pracy było zbadanie wpływu TGFβ na hodowle komórkowe mysich mioblastów linii komórkowej C2C12. Wykazano, że TGFβ silnie indukuje różnicowanie komórek miogennych w kierunku miofibroblastów. Mioblasty stymulowane przy pomocy TGFβ wykazują zmieniony fenotyp oraz rozpoczynają ekspresję białek typowych dla komórek miofibroblastycznych. Za pomocą znakowania immunofluorescencyjnego możliwe było zobrazowanie profilu ekspresji białka markerowego miofibroblastów – α aktyny mięśni gładkich (αSMA) w hodowanych komórkach. Z kolei metoda Western blotting’u pozwoliła na analizę ilościową zmian zachodzących pod wpływem TGFβ w poziomie ekspresji białek – α aktyny mięśni gładkich (αSMA), wimentyny oraz koneksyny43 (Cx43). Zmiany komórkowe indukowane pod wpływem transformującego czynnika wzrostu β (TGFβ) in vitro mogą mieć odzwierciedlenie w różnych procesach zachodzących w żywym organizmie, szczególnie w przebiegu fibrozy mięśni. Dogłębne poznanie procesu włóknienia jest zatem niezbędne dla opracowania skutecznych terapii oraz zapobiegania temu niekorzystnemu zjawisku.Myoblast fusion is an essential process for the growth of muscles during individual development, and regeneration of muscle fibers after their damage. Various signal pathways are involved in differentiation and repair of muscle. Disruption of those signal pathways can lead to numerous pathologies, for example fibrosis. Fibrosis is a process of excessive secretion of extracellular matrix (ECM) components by cells, mostly collagen, and thereby damaging the structure and function of tissue or organ. In muscle fibrosis, myoblasts don't fuse with each other or with adjacent muscle fibers, but instead they adopt the myofibroblastic phenotype and express extracellular matrix proteins at increased level. The most important cytokine involved in fibrosis, and also in scarring, seems to be transforming growth factor β (TGFβ). This factor is secreted in the area of injury by many types of cells, including lymphocytes, platelets, fibroblasts, and regulates the healing process. The aim of this thesis was to study the effect of TGFβ on cell culture of mouse myoblast cell line C2C12. It was shown, that TGFβ strongly induces differentiation of myogenic cells into myofibroblasts. Myoblasts stimulated by TGFβ exhibit an altered phenotype and express proteins typical for myofibroblastic cells. Using immunofluorescence labelling it was possible to image the expression profile of the myofibroblast protein marker – α smooth muscle actin (αSMA) in cultured cells. In turn, Western blotting method allowed for quantitative analysis of changes influenced by TGFβ in the expression level of proteins – α smooth muscle actin (αSMA), vimentin and connexin43 (Cx43). Cellular changes induced under the influence of transforming growth factor β (TGFβ) in vitro may be reflected in various processes occurring in the living organism, especially in muscle fibrosis. In-depth knowledge of the process of fibrosis is essential for the development of efficient therapies and prevention of adverse phenomena