Automatic Histogram Correction Method For Processing 3D Confocal Microscope Images Of Glial Cells

Abstract

A result of specimen scanning is a seriesof 2D images. Consecutive images show deeper sections ofstained tissue. Within a stack of images a light attenuationincreases with the depth of imaged focal planes. This wellknown physical phenomenon is a major obstacle that stands inthe way of any CLSM image based analysis. Because lightattenuation can be compensated by histogram modelingtechniques, a straightforward solution is reached by histogramequalization of all images in a stack. The aim is to remodelshapes of histograms in such a way that the intensity histogramsof the resulting images become uniform within all possiblebrightness values. Numerous histogram equalization methodshave been developed in the last decade. In this paper wepropose a novel 3D histogram equalization algorithm. It istuned to balance contrast and brightness of images within onestack. In this approach a linear correlation ofbrightness among adjacent stack slices is assumed. Unlike other knownalgorithms our approach concentrate more on preservation ofinformation than improvement of visual aspects.The presented algorithm was tested on real data as a moduleembedded in the system for automatic 3D reconstruction ofbrain glial cells. Because this novel method is a powerful andeffective tool for contrast enhancement and achieving evenlybalanced luminescence of confocal stack images it substantiallycontributes to the quality of fully dimensional cellreconstruction.Technika laserowej skanującej mikroskopii konfokalnej CLSM (ang. Confocal Laser Scanning Microscopy) jest uważana za jedno z najistotniejszych rozwiązań mikroskopii optycznej ostatnich dziesięcioleci. Jest ona jednym z najbardziej spójnych narzędzi optycznych obrazowania próbek biologicznych i nie tylko. Jedna z głównych zalet oferowanych przez tę technikę reprezentowana jest przez możliwość dokonywania nieinwazyjnych przekrojów optycznych badanego preparatu. W ten sposób otrzymane stosy obrazów mogą następnie posłużyć do ich przetworzenia w celu uzyskania trójwymiarowych reprezentacji obrazowanych struktur. Możliwość uzyskiwania trójwymiarowych obrazów na podstawie dwuwymiarowych zdjęć z różnych płaszczyzn ogniskowania preparatu w sposób nieinwazyjnych jest zasadniczą zaletą mikroskopii konfokalnej. Ze względu na efekt tłumienia światła może wystąpić wiele problematycznych sytuacji. Tłumienie światła wzrasta wraz z głębokością obrazowanych płaszczyzn ogniskowania. Zjawiskami odpowiedzialnymi za efekt tłumienia światła są jego rozpraszanie oraz absorpcja. Promienie światła są znacząco rozpraszane i pochłaniane przez atomy i cząsteczki zawarte w medium, które napotykane są na drodze do docelowej płaszczyzny ogniskowej. Gdy gęste medium znacząco rozpraszające i pochłaniające światło obecne jest powyżej obszaru skupienia wówczas obraz odpowiadający płaszczyźnie ogniskowej będzie charakteryzował się niższym kontrastem względem analogicznych obrazów powyżej obrazowanego miejsca. W efekcie obrazy w obrębie stosu, które zostały uzyskane przy pomocy mikroskopu konfokalnego, będą różniły się intensywnością. W ramach prezentowanej pracy zaprojektowano, zaimplementowano i przetestowano dwa sposoby poprawy jakości obrazów trójwymiarowych pochodzących z mikroskopu konfokalnego. Proponowane algorytmy działają w sposób automatyczny przez co dobór jakichkolwiek współczynników, czy też przykładowo obrazów referencyjnych przez użytkownika nie jest wymagany. Celem podjętych działań było możliwie jak najlepsze wzmocnienie sygnału zwłaszcza w obrębie głębokich obszarów obrazowanych preparatów. W efekcie zastosowania opracowanych metod nie tylko poprawie ulega kontrast otrzymywanych po przetworzeniu zdjęć, ale zachowana zostaje treść obrazów. Jest to szczególnie istotne zważywszy na fakt, że czy to w ręcznym czy automatycznym przetwarzaniu obrazów, jest to często jedynie etap pośredni analizy wizualizowanych struktur