Kochmańska, Nina

Opolska-Bogusz, Barbara

Piniewska-Róg, Danuta

Sanak, Marek

Stawowiak, Agnieszka

Wojtas, Marta

Archives of Forensic Medicine and Criminology

Polish

Jagiellonian Univeristy Repository

ARCH. MED. SĄD. KRYM., 2009, LIX, 320-325                                   PRACE KAZUISTYCZNEMarta Czarnogórska1, Marek Sanak2, Danuta Piniewska1, Nina Kochmańska1, Agnieszka Stawowiak1, Barbara Opolska-Bogusz1Rzadki wariant alleliczny D19S433*7 w badaniu  spornego ojcostwa z mutacją A rare D19S433*7 variant in the paternity case with mutation1 Z Katedry i Zakładu Medycyny Sądowej UJ CMKierownik: prof. dr hab. n. med. M. Kłys2 Z Zakładu biologii Molekularnej i Genetyki Klinicznej, II Katedry Chorób WewnętrznychKierownik: prof. dr hab. med. M. SanakPodczas rutynowego badania spornego ojcostwa, przy użyciu zestawu autosomalnych loci typu STR-AmpFℓSTR Identifiler stwierdzono brak segregacji allela ojcowskiego w układzie D21S11 oraz poza-drabinowy allel w układzie D19S433. Sugerowało to obecność mutacji w locus D21S11, ponieważ w po-zostałych 14 układach dziecko dziedziczyło allele od domniemanego ojca. Celem uzyskania rekomen-dowanej wartości szansy ojcostwa (PI), poszerzono zakres badań o dodatkowe autosomalne markery genetyczne (Penta D i E) oraz haplotyp chromosomu Y, nie obserwując dalszych wykluczeń ojcostwa. Do-datkowo w badaniu zastosowano nowy zestaw multi-pleksowy PowerPlex ESI 17. Porównanie wspólnych dla PowerPlex ESI 17 i AmpFℓSTR Identifiler układów potwierdziło obecność mutacji w układzie D21S11, natomiast w locus D19S433 u dziecka i domniemane-go ojca potwierdzono obecność rzadkiego wariantu allelicznego D19S433*7. Wariant D19S433*7 nie był dotychczas opisany w polskiej populacji. Prze-wagą zestawu multipleksowego PowerPlex ESI 17, poza rozszerzeniem liczby loci o 6 spoza zakresu multipleksu Identifiler, jest większa liczba wariantów allelicznych we wzorcu. Dokładna analiza każdego z sygnałów fluorescencji, nawet jeśli wykraczają poza zakres wielkości zdefiniowany dla układu, powinna budzić podejrzenie obecności rzadkich wariantów genetycznych.During a routine paternity casework performed with an automated genotyping using the AmpFlSTR Identifiler kit, a lack of paternal allele segregation in D21S11 and off-ladder allele in D19S433 locus was observed. This raised suspicion of mutation because the other systems showed transmission of putative father’s alleles to the child. To achieve the recommended value of paternity index (PI), the range of analysis was extended by additional autosomal loci (Penta D and Penta E) and haplotype of the chromosome Y. No further exclusions were observed. Additionally, a new PowerPlex ESI 17 kit was used. by comparison, the results common for both the multiplex kits confirmed the presence of the mutation in D21S11 locus. In locus D19S433, a rare variant D19S433*7 allele was evidenced in the putative father and the child. This variant allele was included in size range of allelic ladder in the PowerPlex ESI 17 kit, but not in AmpFℓSTR Identifiler kit. The variant D19S433*7 allele was not reported in the Polish population before. The PowerPlex ESI 17 genotyping kit has two advantages, i.e. introduction of 6 loci not included in the Identifiler kit, and extended ranges of allelic ladders. It seems that a careful scrutiny of fluorescent signals following electrophoretic separation is essential to detect rare variant alleles and to avoid misinterpretation of the results.Słowa kluczowe: wariant D19S433*7, do-chodzenie spornego ojcostwa, mutacjaKey words: variant D19S433*7 allele, pater-nity case, mutationNr 4                                                                                                                                                   321WSTęPbadanie polimorfizmu DNA genomowego typu STR jest powszechnie stosowane przy ustalaniu spornego ojcostwa. Komercyjnie dostępne zestawy odczynnikowe pozwalają na ustalenie genotypu z wykorzystaniem multiplek-sowej reakcji PCR, dla silnie dyskryminujących loci człowieka na autosomach i chromosomach płci [1, 2, 3, 4]. Zgodnie z aktualnymi (2009) wytycznymi Komisji Genetyki Sądowej Polskie-go Towarzystwa Medycyny Sądowej i Krymi-nologii szansa ojcostwa (ang. paternity index, PI) musi wynosić co najmniej 1 000 000, aby wynik badania można uznać za potwierdzający biologiczne ojcostwo. Wykluczenie ojcostwa powinno zostać wykazane, na podstawie braku segregacji wariantów genetycznych między do-mniemanym ojcem a dzieckiem, w co najmniej czterech układach polimorficznych. W przypad-ku uzyskania mniejszej szansy ojcostwa, co jest często spowodowane brakiem materiału biologicznego pochodzącego od matki dziecka, albo brakiem segregacji ojcowskiego wariantu allelicznego spowodowanym mutacją w poje-dynczym układzie polimorficznym, zachodzi konieczność poszerzenia zakresu badań o do-datkowe markery genetyczne, ponad minimalną liczbę 10-15 zbadanych loci [5, 6]. Stwierdzenie braku segregacji wariantu allelicznego między ojcem a dzieckiem w jednym locus typu STR jest zjawiskiem rzadkim. Przy założeniu średniej czę-stości mutacji wariantów polimorficznych typu STR 1:400 mejoz oraz badań spornego ojcostwa wykonywanych w zakresie 15 układów STR, mutacje w jednym z układów obserwowane są z częstością około 1 na 30 zbadanych spraw, w których potwierdzono ojcostwo biologiczne. Nowością w genetyce sądowej są loci typu mini-STR, dla których długości produktów ampli-fikacji DNA nie przekraczają 200 par zasad [7, 8]. Ich podstawowym zastosowaniem jest badanie zdegradowanego materiału genetycznego, któ-rego amplifikacja kończy się niepowodzeniem, jeżeli oczekiwane jej produkty są większe od 150 par zasad. Jednym z najnowszych zesta-wów do badań polimorfizmu DNA, w którym połączono jedenaście markerów genetycznych typu mini-STR oraz pięć nowych loci STR reko-mendowanych przez ENFSI (European Network of Forensic Science Institutes), jest zestaw Po-werPlex ESI 17 firmy Promega [9].W Pracowni Hemogenetyki Katedry i Zakładu Medycyny Sądowej Uniwersytetu Jagiellońskie-go Collegium Medicum w Krakowie badania spornego ojcostwa wykonywane są rutynowo przy użyciu zestawu multipleksowego STR-AmpFℓSTR Identifiler (Applied biosystems, USA). W przedstawionym przypadku, podczas automatycznej analizy profilu genetycznego pozwanego mężczyzny oraz dziecka (chłop-ca) i jego matki, stwierdzono pozadrabinowy allel D19S433*7 oraz mutację pochodzenia ojcowskiego w układzie D21S11. Konieczność poszerzenia badań o dodatkowe markery gene-tyczne oraz potwierdzenia wyników uzyskanych zestawem Identifiler skłoniła do wykonania, poza dwoma monopleksami (Penta D i Penta E), ba-dania zestawem PowerPlex ESI 17 oraz Y-Filer.MATERIAł I METODYDo badań wykorzystano materiał w postaci wymazów ze śluzówki policzka jamy ustnej od domniemanego ojca, matki i dziecka zgłaszają-cych się do Zakładu Medycyny Sądowej w celu ustalenia spornego ojcostwa (próbki 348, 349, 350/2009). Genomowe DNA izolowano przy pomocy zestawu Sherlock AX (A&A biotechno-logy, Gdańsk) metodą ekstrakcji enzymatycznej z użyciem kolumn jonowymiennych. badanie w zakresie multipleksowego DNA-STR oraz polimorfizmu loci STR ludzkiego chromosomu Y wykonano wykorzystując amplifikację fragmen-tów DNA z użyciem odczynników AmpFℓSTR Identifiler oraz AmpFlSTR Y-filer firmy Applied biosystems zgodnie z zaleceniem producenta. Amplifikację monopleksu PowerPlex® 16 Mono-plex System Penta D i Penta E oraz multipleksu PowerPlex® ESI 17 System przeprowadzono posługując się odczynnikami firmy Promega.Rozdział elektroforetyczny produktów ampli-fikacji przeprowadzono z wykorzystaniem auto-matycznego sekwenatora AbI Prism 377 (Applied biosystems, USA) na 5% poliakrylamidowym żelu denaturującym (Amresco, USA), stosując odpowiednie macierze kompensacji kolorów i wewnętrzne standardy wielkości DNA: LIZ-500 i CC5 ILS 500, stosownie do analizowanego zestawu odczynnikowego. Wielobarwny obraz żelu analizowano przy użyciu oprogramowania GeneScan Analysis 3.7 NT. Przyporządkowanie nazw alleli przeprowadzono z wykorzystaniem programu komputerowego AbI Prism Genotyper 3.7 NT porównując je z odpowiednimi drabinami allelicznymi. Prawdopodobieństwo ojcostwa ob-liczono przy pomocy programu DNA-VIEW wer-sja 29.03 na podstawie częstości allelicznych dla populacji polskiej, z uwzględnieniem zaistniałej mutacji. Porównanie częstości haplotypu DNA RZADKI WARIANT ALLELICZNY D19S433*7 W bADANIU SPORNEGO OJCOSTWA322                                                                                                                                 Nr 4chromosomu Y człowieka dokonano posługując się bazą populacyjną dostarczoną przez produ-centa zestawu AmpFℓSTR® Y-filer dostępną na stronie internetowej www.appliedbiosystems.com/yfilerdatabase.WYNIKIPrzy użyciu multipleksu AmpFℓSTR Identifi-ler stwierdzono u dziecka w układzie D21S11 (ryc. 1, genotyp 29-30.2) brak segregacji allela Ryc. 1. Fluoregram układu D21S11 wraz z drabiną alleli w badaniu ojcostwa przy użyciu zestawu AmpFℓSTR Identifiler (u góry) i PowerPlex® ESI 17 (u dołu). Próbki 348, 349, 350 odpowiadają domniemanemu ojcu, dziecku i matce. Fig. 1. Fluoregram of D21S11 locus with the allelic ladder in the paternity casework using AmpFℓSTR Identifiler (upper panel) and PowerPlex® ESI 17 (lower panel) kit. Samples 348, 349, 350 correspond to the putative father, child and mother, respectively.Marta CzarnogórskaNr 4                                                                                                                                                   323ojcowskiego (genotyp 28-28). W pozostałych 14 układach dziecko dziedziczyło allele ojcowskie, a we wszystkich 15 zbadanych obecne były allele matczyne. Dodatkowo, u dziecka i po-zwanego w układzie D19S433 zaobserwowano obecność pozadrabinowego allela (D19S433*7) o długości 96,3 nukleotydów. łączna szansa ojcostwa, na podstawie zbadanych 15 loci wy-niosła 33 325,9. Częstość występowania mutacji pochodzenia ojcowskiego dla locus D21S11 szacowana jest na 0,15% [http://www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/mutation.htm]. Poszerzenie zakresu badań o kolejne dwa układy (Penta D i Penta E) wykazało u dziecka segregację alleli ojcowskich, natomiast łączna szansa ojcostwa zwiększyła się do 416 697,1. Obliczone praw-dopodobieństwo ojcostwa po przeanalizowaniu 17 markerów genetycznych, przy założeniu obecności jednej mutacji wynosiło 99,99976%, co było niedostateczne dla wykazania ojcostwa Ryc. 2. Fluoregram układu D19S433 wraz z drabiną alleli w badaniu ojcostwa przy użyciu zestawu AmpFℓSTR Identifiler (u góry) i PowerPlex® ESI 17 (u dołu). Próbki 348, 349, 350 odpowiadają domniemanemu ojcu, dziecku i matce. Fig. 2. Fluoregram of D19S433 locus with the allelic ladder in the paternity casework using AmpFℓSTR Identifiler (upper panel) and PowerPlex® ESI 17 (lower panel) kit. Samples 348, 349, 350 correspond to the putative father, child and mother respectively.RZADKI WARIANT ALLELICZNY D19S433*7 W bADANIU SPORNEGO OJCOSTWA324                                                                                                                                 Nr 4pozwanego mężczyzny. badane dziecko było płci męskiej, zatem wykonano analizę loci STR chromosomu Y. Ustalone haplotypy STR-Y były identyczne w zakresie wszystkich 16 zbada-nych układów u dziecka i domniemanego ojca. Ustalony haplotyp był obserwowany raz na 4114 osób pochodzenia europejskiego, których profile zawarte są w bazie danych producenta zestawu. Po uwzględnieniu tych wyników w ob-liczeniach biostatystycznych, prawdopodobień-stwo ojcostwa wzrosło do 99,99999988%, przy szansie ojcostwa PI=8,57x108, co potwierdziło biologiczne ojcostwo pozwanego. Przy zasto-sowaniu nowego zestawu PowerPlex ESI 17, w którym 11 układów zawartych jest również w zestawie AmpFℓSTR Identifiler, w dodatko-wych 6 układach stwierdzono u dziecka segre-gację alleli ojcowskich. Porównanie wspólnych dla PowerPlex ESI 17 i AmpFℓSTR Identifiler wyników potwierdziło obecność mutacji w ukła-dzie D21S11 oraz występowanie u dziecka i do-mniemanego ojca rzadkiego allela D19S433*7 o długości 166,8 nukleotydów. W zestawie AmpFℓSTR Identifiler brak odpo-wiedniego wzorca dla D19S433*7 oraz węższy zakres możliwych wariantów genetycznych identyfikowanych programem Genotyper (od 9 do 17.2 powtórzeń) spowodował, że zaist-niała konieczność zweryfikowania uzyskanych wyników i potwierdzenia obecności rzadkiego allela D19S433*7. Dlatego też zastosowano zestaw PowerPlex ESI 17, w którym zakres identyfikowanych wariantów D19S433 jest szerszy (od 5.2 do 18.2 powtórzeń). Obliczone ostatecznie prawdopodobieństwo ojcostwa wyniosło 99,99999999999%, przy szansie oj-costwa PI=1,18x1013, co pozwoliło na wydanie opinii o udowodnionym ojcostwie biologicz-nym mężczyzny w stosunku do badanego dziecka.DYSKUSJAW genetyce sądowo-lekarskiej kryteria iden-tyfikacji w ostatnich latach uległy znacznemu zaostrzeniu. Ma to związek ze zwiększeniem liczby badanych układów polimorficznych, i związanym z tym oczekiwaniem wyższych prawdopodobieństw identyfikacji.Mutacje alleli STR są stałym, choć niezbyt częstym zjawiskiem biologicznym. Ich wystę-powanie różni się w zależności od markera genetycznego i wykazuje związek z określonymi wariantami locus, liczbą powtórzeń motywu, jak również jest większa w przypadku mejoz ojcowskich [3, 10]. Większa częstość mutacji ojcowskich niż matczynych tłumaczona jest większą liczbą podziałów komórkowych pod-czas powstawania gamety męskiej. Różnice częstości mutacji między mężczyznami a ko-bietami szacuje się, że pozostają w proporcji jak 17:1 [10]. Locus D19S433 zlokalizowane jest w ob-rębie chromosomu 19 (19q12-13.1; 35.109 Mb) i zawiera czteronukleotydową jednostkę repetytywną (AAGG) [http://www.cstl.nist.gov/div831/strbase/str_d19s.htm]. Wzorzec alleli dla mikrosatelitarnego układu D19S433 jest różny w zależności od stosowanego zestawu markerów genetycznych typu STR. W zesta-wie Identifiler drabina alleli dla locus D19S433 składa się z 15 fragmentów DNA o długości od 106 do 140 nukleotydów, natomiast w zestawie PowerPlex ESI 17 z 20 fragmentów DNA o dłu-gości od 163 do 215 nukleotydów. W bazie NIST (ang. National Institute of Standards and Technology) [http://www.cstl.nist.gov/strbase/var_D19S433.htm] wariant D19S433*7 został opisany sześciokrotnie, z czego w zaledwie dwóch przypadkach podano oszacowanie jego częstości. Częstość populacyjna tego wariantu, podana przez Angelę Withrow wynosi 2 na 8844 przebadanych osób. Dotychczas nie ustalono jego sekwencji, a jego obecność wykazano na podstawie pomiaru wielkości produktu amplifikacji (średnio 93,7 zasady). Przewidywana wielkość wzorca allelicznego D19S433*7 w zestawie Identifiler powinna wynosić 98 nukleotydów, co przy offsecie –2 nukleotydy odpowiada stwierdzonej wielkości 96,3 nukleotydów. Przewidywana wielkość wzorca allelicznego D19S433*7 w zestawie Po-werPlex ESI powinna wynosić 164 nukleotydy, co przy offsecie +2,9 nukleotydów odpowiada stwierdzonej wielkości 166,8 nukleotyda. Występowanie rzadkich wariantów gene-tycznych, odbiegających wielkością od defi-niowanego obszaru genotypowania, dowodzi konieczności dokładnego identyfikowania każ-dego z obserwowanych sygnałów fluorescencji podczas rozdziałów elektroforetycznych. W tym zakresie, nowo wprowadzane zestawy odczyn-nikowe charakteryzują się rozszerzoną liczbą wariantów obecnych we wzorcu allelicznym. Dostępny od kilku miesięcy na rynku polskim zestaw PowerPlex ESI 17 umożliwił ostateczne zweryfikowanie genotypów locus D19S433 u badanego mężczyzny i jego syna oraz po-twierdzenie obecności rzadkiego wariantu D19S433*7. Analiza piśmiennictwa, w którym Marta CzarnogórskaNr 4                                                                                                                                                   325publikowano częstości wariantów allelicznych locus D19S433 [11, 12] sugeruje, że nie był on znaleziony wśród zbadanych łącznie 667 mieszkańców Polski.PIśMIENNICTWO1. butler J. M.: Genetics and genomics of core short tandem repeat loci used in human identity testing. J Forensic Sci. 2006, 51, 253-265.2. butler J. M., Decker A. E., Vallone P. M., Kli-ne M. C.: Allele frequencies for 27 Y-STR loci with U.S. Caucasian, African American, and Hispanic samples. Forensic Sci Int. 2006, 156, 250-260.3. Wenk R. E.: Testing for parentage and kinship. Curr Opin Hematol. 2004, 11, 357-361.4. Szibor R., Krawczak M., Hering S., Edel-mann J., Kuhlisch E., Krause D.: Use of X-linked markers for forensic purposes. Int J Legal Med. 2003, 117, 67-74. 5. Fung W. K., Wong D. M., Hu Y. Q.: Full siblings impersonating parent/child prove most difficult to discredit with DNA profiling alone. Transfusion 2004, 44, 1513-1515.6. berent J.: biostatistical interpretation of DNA paternity testing in cases of closely related alleged and biological fathers. Arch Med Sado-wej Kryminol. 2004, 54, 259-263.7. butler J. M., Shen Y., McCord b. R.: The development of reduced size STR amplicons as tools for analysis of degraded DNA. J Forensic Sci. 2003, 48, 1054-1064.8. Coble M., butler J.: Characterization of New MiniSTR Loci to Aid Analysis of Degraded DNA. J. Forensic Sci. 2005, 50, 43-53.9. Sprecher C. J., McLaren R. S., Rabbach D., Krenke b., Ensenberger M. G., Fulmer P. M., Downey L., McCombs E., Storts D. R.: Power-Plex17 ESX and ESI Systems: A suite of new STR systems designed to meet the changing needs of the DNA-typing community. Forensic Sci Int Genet. Supplement Series 2, 2009, 2-4.10. brinkmann b., Klintschar M., Neuhuber F., Hühne J., Rolf b.: Mutation rate in human microsatellites: influence of the structure and length of the tandem repeat. Am J Hum Genet. 1998, 62, 1408-1415.11. Czarny J., Grzybowski T., Derenko M. V., Malyarchuk b. A., śliwka D. M.: Genetic varia-tion of 15 STR loci (D3S1358, vWA, FGA, TH01, TPOX, CSF1PO, D5S818, D13S317, D7S820, D16S539, D2S1338, D8S1179, D21S11, D18S51, and D19S433) in populations of north and cen-tral Poland. Forensic Sci Int. 2005, 147, 97-100.12. Wysocka J., Kapińska E., Rębała K., Szczerkowska Z., Cybulska L.: Genetyka popu-lacyjna locus D19S433 w regionie Polski północ-nej. Ann Acad Med Gedan. 2005, 35, 181-185.Adres do korespondencji:Pracownia HemogenetykiKatedry i Zakładu Medycyny Sądowej UJ CMul. Grzegórzecka 1631-531 Krakówhemogenetyka@cm-uj.krakow.plRZADKI WARIANT ALLELICZNY D19S433*7 W bADANIU SPORNEGO OJCOSTWA

A rare D19S433*7 variant in the paternity case with mutation

https://ruj.uj.edu.pl/xmlui/bitstream/handle/item/157569/czarnogorska_et-al_rzadki_wariant_alleliczny_D19S433_7_w_badaniu_spornego_ojcostwa_z_mutacja_2009.pdf?sequence=1&isAllowed=y

A rare D19S433*7 variant in the paternity case with mutation

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Jagiellonian Univeristy Repository