建立了采用表面增强拉曼光谱对香肠等食品中亚硝酸盐的快速筛查方法。检测样品经简单提取、衍生后直接进行拉曼光谱检测,整个前处理时间不超过15分钟。通过亚硝酸盐衍生物的指纹图谱定性,本方法能够对各种食品中的亚硝酸盐含量准确筛查,检出限为30 mg/kg,能够满足国家卫生标准的限量要求。该方法前处理简便快速,结果准确,可以作为一种高灵敏、无假阳性的非定向快速筛查手段。该方法可用于检测食品中亚硝酸盐的滥用添加,满足职能部门的现场执法和实验室预检需求。国家自然科学基金（21703187）厦门大学校长基金（20720170102）江苏省产学研前瞻项目（BY2018200

巫明茹

曾勇明

祝惠惠

罗世翊

陈启振

Xiamen University Institutional Repository

722019年第9期中国食品添加剂China Food Additives试验研究表面增强拉曼光谱法在食品中亚硝酸盐的 快速筛查研究祝惠惠 1，2，曾勇明 1，陈启振 1，巫明茹 1，罗世翊 1，*（1. 厦门大学固体表面物理化学国家重点实验室，化学化工学院，厦门 361005； 2. 常州危险货物与包装检测技术中心，常州 213000）摘 要：建立了采用表面增强拉曼光谱对香肠等食品中亚硝酸盐的快速筛查方法。检测样品经简单提取、衍生后直接进行拉曼光谱检测，整个前处理时间不超过 15 分钟。通过亚硝酸盐衍生物的指纹图谱定性，本方法能够对各种食品中的亚硝酸盐含量准确筛查，检出限为 30 mg/kg，能够满足国家卫生标准的限量要求。该方法前处理简便快速，结果准确，可以作为一种高灵敏、无假阳性的非定向快速筛查手段。该方法可用于检测食品中亚硝酸盐的滥用添加，满足职能部门的现场执法和实验室预检需求。关键词：表面增强拉曼光谱；食品；亚硝酸盐；快速筛查 中图分类号：O657.37   文献标识码：A   文章编号：1006-2513（2019）09-0072-05Study on rapid screening of nitrite in food  by using Surface-enhanced Raman SpectroscopyZHU Hui-hui1，2，ZENG Yong-ming1，CHEN Qi-zhen1，WU Ming-ru1，LUO Shi-yi1，*（1. State Key Laboratory for Physical Chemistry of Solid Surfaces，College of Chemistry and Chemical Engineering，Xiamen University，Xiamen 361005；2. Changzhou Testing and Technical Center for Dangerous Goods and Packaging，Changzhou 213000）Abstract：By using surface enhanced Raman spectroscopy，a rapid screening method of determination of nitrite in foods was developed. After simple extraction，the derivative samples were detected directly by the Raman spectroscopy. The whole pretreatment time was less than 15 minutes. Through the fingerprint qualitative analysis of nitrite derivatives，the nitrite content in various foods was accurately screened. The limitation of the detection is as low as 30 mg/kg，which meets the limit requirements of the national health standards. This is a simple，rapid and accurate method，which can be used as a high sensitive，non-false-positive，non-directional and rapid screening method for the detection of nitrite in food. Therefore，this new method meets the requirement for local law enforcement and laboratory pre-inspection.Key words：Surface-enhanced Raman Spectroscopy；food；nitrite；rapid screening收稿日期：2019-05-15基金项目：国家自然科学基金（21703187），厦门大学校长基金（20720170102），江苏省产学研前瞻项目（BY 2018200）。作者简介：祝惠惠，女，工程师，研究方向：食品及食品接触材料中有害物质的检测研究。*通讯作者：罗世翊，男，工程师，研究方向：表面增强拉曼光谱分析检测研究，邮箱：luoshiyi@xmu.edu.cn。732019年第9期中国食品添加剂China Food Additives试验研究食品在加工过程中，为了保持食品的有效期和色泽度，往往会加入一定量的食品添加剂。亚硝酸盐是火腿肠等各种肉制品中常用的护色剂和防腐剂，适量的亚硝酸盐可以使相关食品保持良好的色泽度，延长保存期［1］。然而，亚硝酸盐在一定的条件下能够在人体内转化为亚硝胺类物质，这类物质具有很强的致癌作用［2］。此外，过多地摄入亚硝酸盐，还会降低血液的携氧功能，导致组织缺氧［3］，甚至引发中毒事件。我国《食品添加剂使用标准》GB 2760-2014［4］规定，在肉制品中亚硝酸盐的最大使用量不得超过 150 mg/kg，其残留量不得超过 30 mg/kg。因此，对食品中亚硝酸盐的含量检测已经成为食品质量安全的重要参考指标。目前，亚硝酸盐的检测方法主要有离子色谱法、紫外分光光度法、高效液相色谱法、毛细管电泳法和流动注射法等方法［5-17］。对于食品中痕量亚硝酸盐类物质的检测，实验室的检测流程相当复杂，需要经一系列的提取、过滤、固相萃取净化、衍生、富集等步骤［7］，前处理的复杂程度会导致检测结果风险的增加。尽管上述检测方法准确可靠，可以作为执法鉴定的依据，然而这些方法的前处理过程大多步骤繁琐，而且相关检测仪器昂贵、体积笨重、操作复杂，无法满足政府职能部门进行现场执法的快检需求。因此，发展一种高灵敏、准确可靠且简单的现场快速检测仪器和方法，提高相关市场监管部门的现场应急能力具有非常重要的现实意义。拉曼光谱能够提供分子的指纹信息数据，它是对物质定性的重要光谱技术之一［18］，然而其检测灵敏度不高，因此在痕量有害成分的鉴定中应用较少。借助于纳米结构金属基底的表面等离激元诱导的表面电磁场的增强效应，表面增强拉曼光谱（SERS）可将待测目标物的信号放大数百万倍［19-21］。相比于色谱和质谱等方法，SERS 光谱的最大优势在于检测速度快，仪器携带方便，且操作步骤简单。因此，结合拉曼光谱的指纹图谱特点，发展出操作简便和可靠的前处理技术，可以将 SERS 光谱技术发展成为一种现场快检技术，用于食品安全检测领域［21］。本文提出了一种基于便携式拉曼光谱仪的快速检测方案，作为一种对食品中亚硝酸盐的预检筛查手段，前处理步骤相对简单，耗时较短，可以大大缩短相关职能部门的抽检时间，提高工作效率；由于其筛查速度是标准方法的数倍，仅需采用标准方法对少量阳性检出样品进行定量复测，因此还可以促进相关职能部门提高抽检频率，从而保证食品的质量安全。1 实验部分1.1 材料氯金酸（HAuCl4）、柠檬酸钠、硼砂、亚铁氰化钾、乙酸锌、对氨基苯磺酸、盐酸奈乙二胺等试验中所用试剂皆为分析纯（上海国药），水溶液皆用超纯水配置（Millipore）。1.2 SERS 增强活性的金纳米粒子的制备和表征金纳米粒子由厦门市普识纳米科技有限公司提供，粒径约为 55 nm，利用经典的柠檬酸钠还原 HAuCl4 的方法合成而得［17］。制备过程如下：1.2 mL 1% 柠檬酸钠迅速加入到含有 1 mmol/L HAuCl4 的 100 mL 沸水溶液中，并继续剧烈搅拌40 min，从而得到红色粒径在 55 nm 左右的金纳米溶胶。1.3 实际样品的前处理和 SERS 检测样品的前处理采用锌盐沉淀蛋白方法进行提纯，并在亚硝酸盐与盐酸奈乙二胺衍生化后，结合 SERS 检测的特点进行优化。对于香肠等固体样品，基本步骤如下：1）取 2 g 样品于 25 mL 塑料烧杯，加入 5 mL 的硼砂溶液，超声 5 min。2）取 1 mL 上清液，分别加入 200μL 1% 亚铁氰化钾和 200μL 2% 乙酸锌溶液，以 6000 r/min 转速离心 2 min。3）取上层清液 1 mL，先后各加入 200 μL 的 0.4% 对氨基苯磺酸和 0.2% 盐酸奈乙二胺溶液，静置 5min，待用。整个前处理过程不超过15 min。对于酒品和饮料等液体样品，前处理可略去 1）和 2），直接进行衍生化步骤，处理时间可控制在 10 min 以内。SERS 检测步骤如下：取 200 µL 样品，与 50 µL pers-C1 增强助剂（厦门市普识纳米科技公司提供）、50 µL 金溶胶混合 5 s 后开始拉曼测试，谱图采集时间为 2 ～ 5 s。1.4 拉曼光谱仪分析742019年第9期中国食品添加剂China Food Additives试验研究文 中 SERS 谱 图 皆 于 B&W TEK 公 司 的iRaman 拉曼光谱仪上完成。该仪器的激光波长为785 nm，功率为 275 mW，10 倍物镜下达到样品表面的激光光斑大小约为 80 µm。2 结果与讨论2.1 可行性分析300 600 900 1200 1500119415881419138413061161114313291118Raman Intensity/(a.u)Raman shift(cm-1)  加标30ppm    加标50ppm 加标100ppm   10ppm标准品 香肠空白图 1 不同浓度的亚硝酸盐加标的香肠样品经前处理后 所得到的溶液的 SERS 谱图 Fig. 1 SERS spectra of the solutions being pretreated from sausage samples with different spiked concentrations图 1 给出不同浓度的亚硝酸钠加标的香肠样品经上述前处理过程后得到的水溶液的 SERS 谱图，前处理加分析的总测试时长不超过 15 min。从图中可以观察到：无亚硝酸盐香肠样品的SERS 谱图中，在 300 ～ 1700 cm-1 区间，除了位于 456 和 471 cm-1 的两个相对明显的谱峰外，基本表现为无信号的背景曲线。加标 30 mg/kg 亚硝酸盐后，SERS 谱图上可清晰观察到 1118、1143、1161、1194、1306、1329、1384、1419 和 1588 cm-1 等位置处的尖锐谱峰。随着亚硝酸盐的加标浓度提高到 50 和 100 mg/kg 水平时，这些谱峰的拉曼强度迅速提高。对照 10 mg/kg 标准样品及空白样本的 SERS 谱图，可以确认这些谱峰皆来自于香肠样品中添加的亚硝酸盐，主要归功于亚硝酸盐衍生化后得到的偶氮产物中苯环和 N=N 的不同振动模式的贡献。尽管更明确的谱峰归属指认有待于进一步的理论计算模拟，但是图中所展示的谱峰强度的浓度依赖性及与空白样本的比对结果表明，SERS 方法实现了加标样品中亚硝酸盐的快速、定性和半定量检测。2.2 前处理条件优化为得到图 1 所示信噪比良好的 SERS 谱图，以 30 mg/kg 亚硝酸钠加标的香肠样品为例，我们对固体样品的提取液（硼砂溶液）浓度进行了优化。图 2 为用不同浓度硼砂溶液作为提取液时得到的 SERS 谱图。我们注意到：使用纯水提取固体食品中的亚硝酸盐时，能够获得比较好的 SERS 检测效果；提取液中加入 0.1% 硼砂后，SERS 信号提高了 2 ～ 3 倍，表明硼砂的加入可以显著提升提取液对固体样品中亚硝酸盐的提取效率。在逐步提高硼砂的浓度至饱和的过程中，由 SERS 信号反映出的提取效率先是升高，于提取液为 1% 硼砂溶液时有最强 SERS 信号，比之纯水有 4 ～ 5 倍的提升。对于该范围内，提高硼砂溶液浓度对提取亚硝酸盐效率产生正相关影响的原因可能是：1）在纯水环境中，无碱保护下的亚硝酸根离子在遇到超声及加热时，极易发生分解，生成 NO 和 NO2，造成提取物损失；当加入一定剂量的硼砂时，由于硼砂能在水中水解成碱性缓冲溶液（pH = 9.18），给亚硝酸根离子提供稳定的碱性保护环境，减少亚硝酸根离子的分解，同时还可吸收少量分解出的 NO2。2）硼砂可为下一步的乙酸锌沉淀蛋白步骤提供碱性环境，有利于除杂，并皂化脂肪，减少样品被脂肪颗粒包裹，使亚硝酸根离子更易提取到水相中。在随后增大硼砂浓度的过程中，SERS 信号是下降的，3.4% 硼砂溶液作提取剂时，其 SERS信号比 0.1% 硼砂溶液还要低些，而 6.8% 饱和硼砂溶液提取则基本无信号。我们认为该结果与之前硼砂溶液对亚硝酸盐提取效率的提高是不矛盾的。因为过量的硼砂缓冲溶液可能破坏对氨基苯磺酸提供的酸性反应环境，降低亚硝酸根离子与对氨基苯磺酸和盐酸奈乙二胺的衍生化效率。而本实验最终检测的探针即为衍生化的偶氮产物，当衍生化的生成产率降低，可提供给纳米粒子结752019年第9期中国食品添加剂China Food Additives试验研究合的探针数量减少，相应的 SERS 信号即降低。当探针数量减少至检出限以下时，便出现如 6.8%饱和硼砂提取亚硝酸盐时所出现的 SERS 信号。所以在该浓度范围内，增大硼砂浓度并非不利于对亚硝酸盐的提取，而是不利于衍生化反应的缘故。综上，考虑硼砂溶液对亚硝酸盐提取效率和衍生化反应生成产率的影响，我们选择以 1% 质量浓度的硼砂作为提取剂。300 600 900 1200 1500Raman Intensity/(a.u)Raman shift(cm-1)  纯水       0.1%硼砂 0.5%硼砂   1.0%硼砂 3.4%硼砂   6.8%硼砂 10ppm标准品图 2 不同浓度硼砂溶液提取时，30ppm 亚硝酸盐加标的香肠样品经前处理后所得到的溶液的 SERS 谱图 Fig. 2 SERS spectra of the solutions being pretreated from 30 ppm nitrite spiked sausage samples with different extract concentrations of borax solution2.3 方法的普适性上述前处理条件的优化是基于加标 30 mg/kg 亚硝酸钠的香肠样品，为验证该条件的普适性，我们分别对数十种固体和液体加标样本进行 检测。图 3 给出在香肠、腌菜、海鲜干货、腊肉和隔夜菜等食品样本中加标 30 mg/kg 亚硝酸钠所得到的典型 SERS 谱图。位于 1118、1143、1161、1194、1306、1329、1384、1419 和 1588 cm-1 等位置处的亚硝酸盐衍生化产物的特征拉曼谱峰清晰表明：SERS 方法能对这些基质复杂且多样的食品样本中所含有的痕量亚硝酸盐进行高灵敏的快速检测，尽管这些食品的基质差异显著：如香肠含有动物脂肪和淀粉等，腌菜中含有高浓度的盐分和草酸等，腊肉中含有大量的动物脂肪和蛋白质等。基于拉曼光谱的指纹图谱及 SERS 的特异性识别的特点，进行优化的前处理方案在很大程度上消除了这些基质的干扰，体现出来的差异仅仅是 SERS 谱峰的拉曼强度高低：最高值约为最低值的 2 ～ 3 倍。该结果说明，尽管所采用的前处理方案尚无法完全排除不同介质中的基质干扰，但是并不影响目标物的高灵敏检出。300 600 900 1200 1500119415881419138413061161114313291118Raman Intensity/(a.u)Raman shift(cm-1)  香肠       腌菜 海鲜干货   腊肉 隔夜熟菜图 3 不同食品加标 30 ppm 亚硝酸盐后， 经同种前处理后的溶液的 SERS 谱图 Fig. 3 SERS spectra of the solutions extracted from 30 ppm nitrite spiked various food samples with the same pretreatment protocol pretreatment protocol3 结论综上可知，本研究建立了一种基于表面增强拉曼光谱的亚硝酸盐快速筛查方法，该方法检出限为 30 mg/kg，检测时间短，检测仪器携带方便，可以作为一种灵敏、非定向的快速筛查手段，用于滥用添加亚硝酸盐的食品检测当中，能够满足职能部门的现场执法和实验室预检需求。762019年第9期中国食品添加剂China Food Additives试验研究参考文献：［1］方素珍，陈春祝，苏晓鹏 . 离子色谱法测定肉制品中的硝酸盐及亚硝酸盐 [J]. 中国卫生检验杂志，2011，21（3）：762-771.［2］Bahadoran Z，Mirmiran P，Jeddi S，et al. 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表面增强拉曼光谱法在食品中亚硝酸盐的快速筛查研究

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