Orientadores: Profa. Dra. Madalena Baron, Prof. Dr. José Domingos FontanaDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Curso de Pós-Graduação em BioquímicaInclui referências: p. 77-93Resumo: A composição de venenos de serpentes como sendo mistura complexa de enzimas e de compostos não enzimáticos, com diferentes atividades biológicas, foi confirmada para o veneno de Bothrops cotiara. Os efeitos locais decorrentes de um envenenamento por serpentes, como hemorragia e necrose estão, de alguma forma, relacionados com enzimas proteolíticas, as quais complementadas pelas L-aminoácido oxidases, determinam a degradação das proteínas e boa parte de seus monômeros. O veneno de Bothrops cotiara foi submetido a fracionamento por permeação em gel de Sephadex G-100 associada à cromatografia de troca iônica em DEAE-celulose. Como resultado destas técnicas de fracionamento, foram obtidas: a) nove frações hemorrágicas, sendo que dentre os componentes da fração de permeação de menor faixa de peso molecular (TH-3), o refracionamento por troca iônica permitiu recuperar na faixa de acidicidade média (TH-3b) a fração com maior atividade hemorrágica. O zinco (Zn2+) foi confirmado como cofator destas metalo-proteinases. b) oito frações proteolíticas sobre a caseína, sendo que o melhor fator de purificação (6.67) foi conseguido simplesmente por filtração em gel, na faixa mais elevada de peso molecular (PC-1). c) nove frações coagulantes "thrombin-like", sendo que as sub-frações de média acidicidade da troca iônica (AC-c e AC-e), derivadas inicialmente da população proteica de maior peso molecular da filtração em gel (AC-1), localizaram os componentes mais efetivos (IC = 41.7) bem superior portanto à aquela verificada para o veneno bruto (IC = 7.7). d) doze frações para L-aminoácido oxidase (LAO), por permeação em gel combinada com troca iônica, sendo que a sub-fração com a maior atividade encontrada, de pequeno conteúdo proteico (LAO-lc), foi mais sujeita a inativação enzimática se comparada com as demais. Uma maior resolução do conjunto de isoenzimas para LAO foi obtida com a metodologia de isoeletrofocalização em poliacrilamida (PAGE-IEF) acoplada ao zimograma, medido com L-metionina e L-leucina como substratos. Um perfil enzimático constituído de até 18 bandas para LAO sobre uma população proteica de 36 bandas foi, pioneiramente neste trabalho, encontrado no veneno de Bothrops cotiara. O FAD (flavina adenina dinucleotídeo) foi confirmado como coenzima do conjunto de LAOs. O perfil proteico complexo do veneno de Bothrops cotiara foi igualmente confirmado através de cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) e por eletroforese capilar de alta resolução (CE).Abstract: The known complex of bioactive compounds comprising snake venoms was particularly examined in the Bothrops cotiara venom. Focus was set in the enzymatic activities closely related to the tissue damage following venom inoculation, such as hemorrhaging, proteases, and L-amino acid oxidases activities. The Bothrops cotiara venom was submitted to fractionation by gel-permeation in Sephadex G-100 and ion-exchange chromatography in DEAE-cellulose, and the results were: a) nine hemorrhagic fractions, the most active being found within the middle molecular weight (TH-3) and middle acidic charge protein subpopulation (TH-b). The zinc ion was confirmed as co-factor of these metalloproteinases. b) eight proteolytic fractions measured with casein, and among them, the highest purification factor (6.67) simply resulted from gel permeation as the component (s) of the highest molecular weight range (PC-1). c) nine thrombin-like fractions whose features displayed relatively high molecular weight (AC-1) and middle acidicity (AC-c and AC-d). The maximum enrichment obtained (CI=41.7) by far exceeded the basal activity of the crude venom (CI=7.7). d) twelve fractions for L-amino acid oxidases (LAO) resulted from combined gel permeation and ionic exchange. A remarkable resolution for the whole isoenzymes was obtained by polyacrylamide gel isoelectrofocusing (PAGE-IEF) coupled to LAO zymogram using L-methionine or L-leucine as substrates. This enzymatic profile, a pioneer research in Bothrops cotiara venom, consisted up to eighteen LAO bands amongst thirty six protein bands. FAD (flavin adenin dinucleotide) was confirmed as the enzymatic cofactor for LAO(s). The microheterogenity of Bothrops cotiara venom proteins was also assessed by high performance liquid chromatography (HPLC) and by high voltage capillary electrophoresis (CE)
