Fusion de la chitosanase de Streptomyces lividans N174 avec un module d'attachement à la cellulose et étude de la protéine modifiée

Abstract

Le chitosane (un dérivé partiellement ou totalement déacétylé de la chitine) a connu, depuis les cinq dernières années, un regain d'intérêt auprès des chercheurs depuis qu'on a découvert tout le potentiel d'applications aussi bien industrielles, médicales, phytosanitaires qu'environnementales que recèle ce polymère. Par exemple, le chitosane est utilisé dans la fabrication de peaux artificielles pour grands brûlés ou comme immunoadjuvant et agent antitumoral; il sert comme additif alimentaire; et il peut aussi servir de matrice dans la récupération des composés organiques et des métaux lourds dans les eaux potables. L'éventail des applications pourrait encore s'étendre si des oligomères de chitosane étaient commercialement disponibles. Ils offrent l'avantage d'être hydrosolubles et donc d'être plus facilement absorbables aussi bien par les cellules animales que par les cellules végétales. Entre autres applications, les chitooligosaccharides peuvent servir d'adsorbants sélectifs des gammaglobulines pour les patients atteints de maladies autoimmunes, d'adsorbants viraux pour les préparations sanguines et peuvent servir également dans le traitement de maladies de la peau et des muqueuses contre les pieds d'athlète, les bactéries opportunistes chez les brûlés ou les levures responsables de vaginites. Les éliciteurs sont des molécules qui peuvent induire la biosynthèse des phytoalexines et des protéines liées à la pathogénèse chez les plantes. Comme éliciteur, le chitosane active des gènes spécifiques qui codent pour au moins vingt protéines liées au mécanisme de défense chez les plantes. Cependant il existe des microorganismes, en particulier les Actinomycètes, qui produisent des chitosanases, enzymes qui catalysent l'hydrolyse des ponts glycosidiques du chitosane en oligomères et / ou monomères de chitosane. Il y a donc là une voie biologique qui s'offre en alternative aux méthodes chimiques conventionnelles de chitosanolyse. Il a été récemment isolé du sol un Actinomycète, Streptomyces sp. N174, très actif dans la dégradation du chitosane. Cependant cette chitosanase ne dégrade efficacement que le chitosane soluble et très peu le chitosane microcristallin produit industriellement par déacétylation alcaline de la chitine. On peut donc soupçonner que la faible activité de la chitosanase sur le chitosane microcristallin est due à un mauvais attachement sur ce substrat et donc à un manque de spécificité enzyme/ substrat. Avec les nouvelles techniques qu'offre le génie protéique, il est possible de réaliser une fusion entre le gène de la chitosanase et un module d'attachement à la cellulose, de manière à produire une chitosanase chimérique dotée, cette fois, d'une meilleure et plus grande spécificité pour un substrat microcristallin avec l'espoir d'une activité chitosanolytique décuplée vérifiable par cinétique enzymatique. Dans ce travail de recherche il s'agira donc d'opérer une fusion entre le gène de la chitosanase de Streptomyces sp. N174 et le module d'attachement à la cellulose de l'exoglucanase de Cellulomonas fimi. La protéine de fusion qui sera exprimée par le gène chimérique sera étudiée par la suite pour son activité sur le chitosane soluble et sur le chitosane microcristallin en comparaison avec l'activité de la chitosanase de type sauvage sur ces mêmes substrats