京都大学0048新制・課程博士博士(工学)甲第19003号工博第4045号新制||工||1622(附属図書館)31954京都大学大学院工学研究科分子工学専攻(主査)教授 白川 昌宏, 教授 佐藤 啓文, 教授 梶 弘典学位規則第4条第1項該当Doctor of Philosophy (Engineering)Kyoto UniversityDGA

Colomer, Soria E.

Pearson, Timothy Marc

Wolgemuth, Jennifer R.

Education Policy Analysis Archives

Murayama, Shuuhei

Kyoto University Research Information Repository

Title Development of solution NMR method for observation andanalysis of proteins inside cells( Abstract_要旨 )Author(s)Murayama, ShuuheiCitationKyoto University (京都大学)Issue Date2015-03-23URL http://dx.doi.org/10.14989/doctor.k19003Right学位規則第9条第2項により要約公開Type Thesis or DissertationTextversionnoneKyoto University 京都大学 博士（  工  学） 氏名 村山 秀平 論文題目 Development of solution NMR method for observation and analysis of proteins inside cells （核磁気共鳴法による細胞内タンパク質の観測及び手法開発）  （論文内容の要旨）  本論文は、核磁気共鳴法（ＮＭＲ法）により、細胞内タンパク質の観察・解析及びそのための手法を開発し、タンパク質の細胞内における構造・物性に関する知見を取得し、結果をまとめたものであって、３部から構成されている。  第１部は序論であり、生体高分子に対する構造学的研究とその手法について、主に 核磁気共鳴法について論じている。また、本論文の研究対象とした、モデルタンパク質に関して、明らかになっている機能や物性と生体内における重要性についても記述している。  第２部は３つの章から構成されている。 第２部第１章では、ＮＭＲ法において、高感度な核種である（フッ素）１９Ｆ核を用いた１９Ｆ ＮＭＲをｉｎ－ｃｅｌｌ ＮＭＲ法に適用した手法開発について記述している。ＦＫＢＰ１２タンパク質をモデルタンパク質として用い、ｐ－フルオロ－Ｌ－フェニルアラニンにより標識を施し、ｉｎ－ｃｅｌｌ １９Ｆ ＮＭＲ測定を行った。結果、細胞内における１９Ｆ ＮＭＲスペクトルの取得に成功した。また、細胞内ＮＭＲスペクトルと試験管内でのＮＭＲスペクトルのシグナルの半値幅を比較することで、ＦＫＢＰ１２のフェニルアラニン残基に関して、残基特有のダイナミクスを観察することが可能であった。またＦＫＢＰ１２と相互作用することが知られている薬剤（免疫抑制剤）のＦＫ５０６やＲａｐａｍｙｃｉｎを投与して、細胞内におけるＦＫＢＰ１２の１９Ｆ ＮＭＲスペクトルを測定した。それらの結果から、ＦＫＢＰ１２と２つの薬剤との相互作用が検出可能であることが示された。また、Ｒａｐａｍｙｃｉｎを用いた場合には、ｉｎ－ｃｅｌｌ  ＮＭＲスペクトルとｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＮＭＲスペクトルとでスペクトルの違いが確認された。そのため、ＦＫＢＰ１２－Ｒａｐａｍｙｃｉｎ複合体において、細胞内環境の影響を受け、相互作用様式が細胞内と試験管内で異なっている可能性が示唆された。 第２部第２章では、ｉｎ－ｃｅｌｌ ＮＭＲ法による筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）関連タンパク質であるＳＯＤ１の細胞内における構造学的研究について記述している。本章では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、凝集体を形成することが報告されている全長ＳＯＤ１及びループを切断した変異体ＳＯＤ１（ＳＯＤ１ΔＩＶΔＶＩＩ）を実験に用いた。ｉｎ－ｃｅｌｌ ＮＭＲ法により、全長ＳＯＤ１ではＮＭＲスペクトルを取得できなかったが、変異体ＳＯＤ１に関して細胞内におけるＮＭＲスペクトルの取得に成功した。測定の結果、ｉｎ－ｃｅｌｌ  ＮＭＲスペクトルと生理的な条件であるｐＨ  ７．４での試験管内でのＮＭＲスペクトルが、異なっている領域が確認された。結果、これはヒスチジン残基のプロトネーションが原因であることを明らかにした。加えて、今回測定に用いているＮＭＲチューブ内でストレスを受けた細胞では、細胞内がｐＨ ６．２±０．２程度の酸性条件になっていることが明らかになった。また、測定時間中は、変異体ＳＯＤ１に関して細胞内環境下でも、安定な構造を維持し、凝集を起こさないことが示された。本研究が、タンパク質のミスフォールディングや凝集が原因とされる疾患に関して、その原因タンパク質の細胞内における構造情報を取得京都大学 博士（  工  学） 氏名 村山 秀平 し、疾患メカニズム解析に寄与する一つのストラテジーを提案した。 第２部第３章では、細胞内におけるタンパク質の分子内ジスルフィド結合の物性に関する研究について記述している。多くのタンパク質が、分子内あるいは分子間に、ジスルフィド結合を有している。これらタンパク質のジスルフィド結合は、多くの生命現象において、重要な役割を担っていることが知られている。本研究では、溶液ＮＭＲ法により、細胞内におけるタンパク質分子内ジスルフィド結合の被還元速度を定量することに成功した。実験には、分子内にジスルフィド結合を持つタンパク質ＣｓｋのＳＨ２ ドメインを用いている。また、細胞内の主要な還元剤であるグルタチオンの生合成を阻害することで、細胞内を酸化的な条件にし、同様の実験を行った結果、非還元速度の低下が確認できた。このことから、ＳＨ２ドメインのジスルフィド結合をプローブとして、細胞内の酸化還元状態の変化を検出できることが示された。さらに、試験管内での結果と比較することで、タンパク質分子内ジスルフィド結合をプローブとして、細胞内の酸化還元電位を評価することに成功した。得られた細胞内の酸化還元電位は、従来報告されていた値よりも、より還元的な値であった。これは、タンパク質の分子内ジスルフィド結合の物性が、細胞内環境の影響を受けることが原因と考えられる。特に、本研究の解析から、細胞内において、分子込み合い効果が大きく影響を与えていることが原因の一つであることが示唆された。  第３章は、結論であり、本論文で得られた成果について要約し、また研究の今後の発展性について記述している。                       氏 名 村 山 秀 平 （論文審査の結果の要旨）  本論文は、核磁気共鳴法（ＮＭＲ法）による細胞内タンパク質の観察・解析及びそのための手法開発について論じている。この研究で得られた成果は以下のとおりである。  1.  ＮＭＲ法において、高感度な核種であるフッ素（１９Ｆ）核を用い、ｉｎ－ｃｅｌｌ ＮＭＲ法に適用した。結果、細胞内の観測対象タンパク質を特異的に観測できることを示した。また、細胞内の観測対象タンパク質と細胞外から投与した薬剤との相互作用を検出できることを示した。加えて、従来の二次元１Ｈ－１５Ｎ ＮＭＲ測定を用いたｉｎ－ｃｅｌｌ ＮＭＲ法と比較して、少なくとも４倍程度の感度の向上を実現した。  2.  細胞内で凝集することが、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の原因の一つと考えられているタンパク質ＳＯＤ１の細胞内における構造学的研究を行っている。ｉｎ ｖｉｔｒｏで凝集体を形成する変異体ＳＯＤ１を用い、細胞内におけるＮＭＲ測定に成功した。結果、測定時間中は、細胞内環境下でも、安定に構造を保っており、凝集を起こさないことが示された。本研究により、タンパク質のミスフォールディングや凝集が原因とされる疾患に関して、その原因タンパク質の細胞内における構造情報を取得し、疾患メカニズム解析に寄与する一つのストラテジーを確立した。  3.  溶液ＮＭＲ法により、細胞内におけるタンパク質分子内ジスルフィド結合の被還元速度を定量することに成功した。実験には、分子内にジスルフィド結合を持つタンパク質ＣｓｋのＳＨ２ドメインを用いている。また、結果から、タンパク質分子内ジスルフィド結合をプローブとして、細胞内の酸化還元電位を評価することに成功した。   以上、細胞内におけるタンパク質の観察・解析のための手法を開発し、その過程でタンパク質の細胞内における構造・物性に関する情報を取得した本論文の内容と成果は、学術上、実際上寄与するところが少なくない。よって、本論文は博士（工学）の学位論文として価値あるものと認める。また、平成２７年２月２４日、論文内容とそれに関した事項について諮問を行った結果合格と認めた。   なお、本論文は、京都大学学位規程第１４条第２項に該当するものと判断し、公表 に際しては、当該論文の全文に代えてその内容を要約したものとすることを認める。   

核磁気共鳴法による細胞内タンパク質の観測及び手法開発

Public schools in some areas of the U.S. are as segregated as they were prior to court-ordered busing, in part due to school choice policies that appear to exacerbate extant segregation. In particular, Latina/o students are increasingly isolated in schools characterized as being in cycles of decline. Our case study of one such school is based on a reanalysis of interview, focus group, and survey data from three research and evaluation projects. We constructed accounts of parents’ decisions to leave and remain at Martinez Elementary, a segregated dual language school experiencing increases in Latina/o and low socio-economic student enrollment and decreasing statewide standardized test scores. Interpreting Latina/o and White parents’ accounts through LatCrit theory, we sought to understand their choices to attend this school as counterstories that illustrate conflicting forces influencing Martinez, including high parent satisfaction and interest convergence between White and Latina/o parents. These stories depict a more hopeful account of a school resisting decline, yet only the adoption of managed school choice policies may be powerful enough to counter the school’s segregation.Escuelas públicas en algunas áreas de los EE.UU. son tan segregadas como estaban antes de que se impusiera por orden judicial procesos de desegragación a través  de transporte escolar, en parte debido a las políticas de elección de escuelas que parecen agravar la segregación existente. En particular, se aíslan cada vez más las escuelas con estudiantes Latinos que parecen caracterizarse por estar en ciclos de decadencia. Nuestro estudio de casos de una de estas escuelas se basa en un nuevo análisis de los datos de tres proyectos de investigación y evaluación. Construimos narrativas de las decisiones de los padres de salir y/o permanecer en una escuela primaria bilingüe que experimentaba aumento en la matrícula de estudiantes Latinos y de con bajo poder socioeconómico y una disminución en los resultados en exámenes estandarizados en todo el estado. Interpretando las narrativas de los padres Latinos y blancos a través de la teoría LatCrit, hemos tratado de entender sus opciones para mandar o retirar sus hijos a esta escuela para ilustran las fuerzas contradictorias que influyen la situación en la escuela, incluyendo niveles de satisfacción altos de los padres y la convergencia de intereses entre padres Latinos y Blancos. Estas historias representan un relato más esperanzador de una escuela que resiste una espiral descendente, sin embargo, sólo la adopción de otras políticas de elección escolar podrían ser lo suficientemente fuertes para contrarrestar las fuerzas de segregación escolar.As escolas públicas em algumas áreas de os EUA são tão segregado como eram antes de ser imposta por decisão judicial processos de de-segregação através do transporte escolar, em parte devido às políticas de escolha da escola que parecem agravar a segregação existente. Em particular, escolas com estudantes latinos parecem se isolar ainda mais e ser caracterizadas por ciclos de decaimento crescentes. Nosso estudo de caso de uma dessas escolas é baseado em uma nova análise de dados de três pesquisas e avaliações. Nós construimos narrativas com as decisões dos pais para sair ou ficar em uma escola primária bilíngüe experimentando um aumento nas matrículas de estudantes latinos e baixo poder socioeconômico e uma diminuição nos resultados dos exames estaduais padronizados. Interpretando as narrativas dos pais latinos e brancos através da teoria LatCrit, tentamos compreender as opções para enviar ou retirar os seus filhos de esta escola e para ilustrar as forças contraditórias que influenciam a situação na escola, incluindo altos níveis de satisfação dos pais e a convergência de interesses entre os pais latinos e brancos. Essas histórias representam uma história mais esperançosa de uma escola que resiste a uma espiral descendente, no entanto, apenas a adoção de outras políticas de escolha escolar poderiam ser o suficiente fortes para neutralizar as forças de segregação escolar

Education Policy Analysis Archives (E-Journal - Arizona State University)

English

Espiral Descendente ou “Farol de Esperança”: Histórias de Escolha Escolar em uma Escola Bilíngue

Public schools in some areas of the U.S. are as segregated as they were prior to court-ordered busing, in part due to school choice policies that appear to exacerbate extant segregation. In particular, Latina/o students are increasingly isolated in schools characterized as being in cycles of decline. Our case study of one such school is based on a reanalysis of interview, focus group, and survey data from three research and evaluation projects. We constructed accounts of parents’ decisions to leave and remain at Martinez Elementary, a segregated dual language school experiencing increases in Latina/o and low socio-economic student enrollment and decreasing statewide standardized test scores. Interpreting Latina/o and White parents’ accounts through LatCrit theory, we sought to understand their choices to attend this school as counterstories that illustrate conflicting forces influencing Martinez, including high parent satisfaction and interest convergence between White and Latina/o parents. These stories depict a more hopeful account of a school resisting decline, yet only the adoption of managed school choice policies may be powerful enough to counter the school’s segregation

Pearson, Timothy

Colomer, Soria Elizabeth

Scholar Commons - University of South Florida

Spiral of Decline or “Beacon of Hope:” Stories of School Choice in a Dual Language School

USFSP Digital Archive

http://repository.kulib.kyoto-u.ac.jp/dspace/bitstream/2433/199327/1/ykogk04045.pdf

核磁気共鳴法による細胞内タンパク質の観測及び手法開発

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