Études immunologiques de la poly(ADP-ribose) polymérase

Abstract

Des anticorps polyvalents dirigés contre la poly(ADP-ribose) polymérase ont été purifiés et caractérisés à partir d'antisérum produit par un lapin immunisé avec de l'enzyme purifié. Nous avons utilisé ces anticorps selon divers protocoles expérimentaux afin de caractériser davantage la poly(ADP-ribose) polymérase. Premièrement, ces anticorps ont permis la localisation de l'enzyme associée à la chromatine isolée par la mise au point d'une technique de microscope électronique utilisant un double marquage en solution. Cette méthode consiste à incuber la chromatine séquentiellement avec l'anti­polymérase puis avec la Protéine-A couplée à l'or colloidal. Les polynucléosomes marqués sont séparés par gradient de sucrase et visualisés par microscopie électronique. Deuxièmement, les anticorps ont été utilisés pour l'analyse de l'automodification de la poly(ADP-ribose) polymérase ainsi que de sa dégradation dans les cellules fibroblastiques de souris C3H10T1/2 traitées avec un agent causant la promotion tumorale, le phorbol-12-myristate-13-acétate ( MA). Dans cette étude, les protéines modifiées par le poly(ADP-ribose) ont été purifiées par chromatographie d'affinité, séparées sur gel de polyacrylamide, transférées sur filtre de nitrocellulose et révélées avec les anticorps spécifiques. Nous avons mis en évidence l'automodification de la poly(ADP-ribose) polymérase dans des cellules traitées avec l'agent promoteur de tumeurs et nous avons montré une dégradation de l'enzyme que l'on n'observe pas dans les cellules non-traitées. L'action catalytique et la régulation de la poly( ADP-ribose) polymérase pourraient donc être modifiées lors des mécanismes de cancérogénèse. Troisièmement, les anticorps purifiés ont servi à l'étude de la régulation de la poly(ADP-ribose) polymérase en fonction du cycle cellulaire. Pour cette analyse, nous avons utilisé une méthode de synchronisation par sélection utilisant un analyseur-trieur de cellules (F.A.C.S.). Des cellules non-synchronisées en croissance exponentielle ont été marquées premièrement avec l'anti-polymérase fluorescent et deuxièmement au 4'-6-Diamidino-2-phénylindole (DAPI), ce qui permet de quantifier le contenu en ADN de chaque cellule. Par cette méthode, nous obtenons des cellules doublement marquées dont il est possible d'analyser par cytofluorométrie, la distribution quantitative de poly(ADP-ribose) polymérase en fonction du cycle cellulaire. On observe que la synthèse de l'enzyme s'effectue à la frontière Gl/S, que le contenu de l'enzyme est stable en phase S et que l'enzyme est plus active en phase G2+M sans une accumulation associée du contenu en poly(ADP-ribose)polymérase. Ces résultats suggèrent une activation de la polymérase en phase G2+M du cycle cellulaire