Étude de la recombinaison intermoléculaire dans les cellules de mammifères

Abstract

Nous avons étudié la recombinaison intermoléculaire dans les cellules de souris grâce à l'utilisation de substrats viraux. La molécule précurseur utilisée pour nos essais de recombinaison est constituée d'un génome complet de polyome (Py) cloné dans un vecteur bactérien. Cette molécule possède donc une région virale interrompue, au site de clonage, par plus de 3,6 kb d'ADN plasmidique. Lorsque nous cotransfectons cette dernière avec une molécule homologue dont la séquence virale correspondante est continue, on constate qu'il y a excision des séquences plasmidiques présentes dans le précurseur cloné, et qu'il en résulte la formation d'un génome Py de longueur unitaire. Cet événement s'effectue vraisemblablement par recombinaison intermoléculaire. Nous avons déterminé dans quel état devaient se trouver les ADN cotransfectants pour permettre l'élimination des séquences plasmidiques. Ceux-ci peuvent êtres transfectés sous forme circulaire ou linéaire et peuvent posséder ou non une origine de réplication fonctionnelle dans les cellules de souris. Ainsi, même des fragments synthétisés par PCR ont été utilisés avec succès. Par ailleurs, l'efficacité de la recombinaison dépend de l'homologie qu'il y a entre les deux molécules cotransfectées. Ainsi, une homologie de 1200 pb environ est nécessaire pour détecter un événement de recombinaison. De plus, nous avons mis en évidence un phénomène d'échange ou de correction des séquences flanquant le site de clonage du précurseur. L'étendue sur laquelle peut s'effectuer cet échange ou cette correction dépend de l'homologie existant entre les molécules cotransfectées, et dans le meilleur des cas, de 800 à 1100 pb de part et d'autre du site de clonage sont sujets à des modifications. Nous avons également montré que la réplication de la molécule précurseur n'est pas un élément initiateur de la recombinaison et que le site de clonage du précurseur ne semble pas empêcher la formation de génomes Py libres. Finalement, nous avons tenté, sans succès, de mettre en évidence un produit de recombinaison réciproque au produit normalement détecté (génome Py). Nous ne pouvons donc pas savoir si l'excision des séquences plasmidiques résulte d'un mécanisme de double crossing-over, de doublestrand break repair ou encore de single-strand annealing