Rôles de la région COOH-terminale des isoenzymes de la fructose-1, 6-bisphosphate aldolase dans le mécanisme et la spécificité enzymatique

Abstract

La fructose-1,6-bisphosphate aldolase est une enzyme glycolytique abondante qui catalyse de façon réversible le clivage du fructose-1,6-bisphosphate en glycéraldéhyde-3- phosphate et dihydroxyacétone phosphate. Chez les mammifères, trois formes d'isoenzyme (A, B ou C) existent et exhibent des différences considérables au niveau de la catalyse et de la spécificité envers leurs substrats. En utilisant le modelage moléculaire ("computer modelling") avec les coordonées cristallographiques de l’aldolase de muscle de lapin de concert avec l'alignement des séquences d'acides aminés des diverses aldolases, le domaine COOH-terminal a été identifié comme étant la région qui pouvait être responsable des variations enzymologiques observées. Afin de tester cette hypothèse, un système d'expression du cDNA de 1'aldolase de maïs dans E.coli a été développé et l'enzyme recombinante fut caractérisée. L'aldolase de maïs recombinante purifiée a une masse moléculaire, un assemblage tétramérique de ses sous-unités et un mécanisme de réaction correspondant à ceux attendus pour les aldolases de classe I. La mutagénèse dirigée a ensuite été utilisée pour étudier le rôle fonctionnel du domaine COOH-terminal. Dans un premier temps, une seule mutation a été produite à chacun des neuf derniers acides aminés. Les mutations apportées à la région COOH-terminale ont influencé très significativement les profils d'activité catalytique de l'aldolase de maïs originale. Les effets des mutations sur les vitesses de clivage du Fru-1,6-P2 et du Fru-l-P, la vitesse de condensation des trioses phosphates et la vitesse d'oxydation de 1'intermédiaire carbanion-ènamine ont été caractérisés. Cette caractérisation cinétique nous a permis de démontrer que les mutations ponctuelles affectent de façon prédominante l'échange du proton au complexe enzyme-dihydroxyacétonephosphate à 1'étape de l'intermédiaire carbanion-ènamine et que cette dernière étape représente probablement l'étape limitante dans le mécanisme catalytique de l'aldolase de maïs recombinante. Les cDNAs des aldolases de maïs et de foie humain ont ensuite été utilisés afin de produire plusieurs (huit) aldolases chimériques (aldolases comportant des domaines COOH-terminaux provenant d'autres aldolases). Les résultats obtenus avec les aldolases chimériques combinés avec ceux des mutants ponctuels ont permis de montrer que le domaine COOH-terminal agit comme puissant modulateur de l'activité enzymatique (augmentation par un facteur 3.3 ou diminution par un facteur 10) et que cette modulation est accomplie via l'altération de processus cinétiques ou par la modification de la stabilité d'un ou plusieurs complexe(s) central(aux). Nos résultats ont aussi permis de montrer l'importance des acides aminés non-homologues adjacents à la tyrosine terminale lors de la catalyse. Le fait qu'un nombre restreint de substitutions d'acides aminés dans la région COOH-terminale permette une modulation significative du profil cinétique des isoenzymes parentales suggère que la séquence de la région COOH-terminale pourrait avoir été une cible privilégiée ("hot spot") utilisée afin de générer une diversité de propriétés cinétiques