Étude du site actif de la chitosanase de Streptomyces sp. N174

Abstract

Depuis plusieurs années, la recherche scientifique s'est penchée sur l'étude d'un polymère naturel nommé le chitosane. Cet intérêt marqué pour le chitosane et ses dérivés, en particulier ses oligomères, n'est pas le fruit du hasard puisqu'il touche à des applications aussi vastes que l'agriculture, la pharmaceutique et le biomédical. L'obtention d'oligomères de chitosane de qualité passant par l'hydrolyse enzymatique du chitosane, la recherche concernant l'étude des chitosanases s'est donc intensifiée au cours des dernières années. L'utilisation des chitosanases est d'ailleurs déjà passée au stade industriel dans plusieurs entreprises québecoises. Malgré ce stade industriel avancé, nous ne possédons que peu de connaissances fondamentales sur la façon dont ces enzymes clivent le chitosane. L'objectif principal des travaux de doctorat présentés ici a été de parfaire les connaissances concernant les rapports structure-fonction des chitosanases. Cet objectif a été atteint en étudiant le rôle spécifique de plusieurs résidus du site actif de la chitosanase de Streptomyces sp. N174 (Csn N174), enzyme utilisée pour la production de à l'échelle industrielle. Les ressemblances structurales et fonctionnelles entre la Csn N174, membre de la famille 46 des glycosides hydrolases (GH), et les chitinases et les lysozymes des familles GH 19, GH 22, GH 23 et GH 24 font de cette chitosanase un modèle expérimental de choix pour l'acquisition de nouvelles données concernant les enzymes membres de toutes ces familles. Dans un premier temps, ce projet a permis d'expliquer l'activité enzymatique résiduelle considérable observée chez la Csn N174 privée de son résidu catalytique nucléophile (mutant D40G). Il a été suggéré que, dans le contexte où l'aspartate 40 est substitué en glycine, un réarrangement du lobe supérieur du sillon catalytique de l'enzyme permet à un autre acide aminé carboxylique, le glutamate 36, de prendre le relais de la fonction de nucléophile. Cette situation peu commune serait possible grâce à l'augmentation de la flexibilité du lobe supérieur du domaine catalytique engendrée par l'ajout d'une glycine en position 40. Dans un deuxième temps, certains résidus conservés au sein des chitosanases appartenant à la même famille de glycosides hydrolases que la Csn N714 (GH 46) ont été étudiés en détails. Les travaux réalisés ont permis de mettre en relief le caractère essentiel de la thréonine en position 45 pour le fonctionnement efficace de l'enzyme. Ce résidu serait impliqué dans le positionnement adéquat de la molécule d'eau nucléophile participant à l'attaque des liens [bêta]-1,4 qui unissent les unités glucosamines et N -acétylglucosamines contenues dans le chitosane. L'implication de l'arginine située en position 42 a fait l'objet de travaux. L'étude de plusieurs mutants de cette position a démontré que l'arginine 42 contribue à la création d'un microenvironnement électrostatique favorable à l'accomplissement de la fonction nucléophile du résidu catalytique aspartate 40. Cette même étude a permis d'établir que cette arginine serait non seulement impliquée dans le maintien de l'intégrité de la fonction catalytique, mais aussi dans le mécanisme de liaison enzyme-substrat de la Csn N174. Dans un troisième temps, les travaux effectuées ont mis en lumière la participation des résidus à caractère acide glutamate 197 et aspartate 201 dans le mécanisme d'attachement enzyme-substrat de la Csn N714 en plus de confirmer l'importance majeure du résidu aspartate 57 dans ce mécanisme. Dans l'ensemble, les résultats issus de ce projet de doctorat ont permis d'approfondir les connaissances sur les rapports structure-fonction de la chitosanase de Streptomyces sp. N174 et, par extension, sur les enzymes partageant des similitudes structurales et fonctionnelles avec cette dernière