Expression, purification et caractérisation structurale et thermodynamique des complexes formés de la reconnaissance moléculaire des domaines B-HLH-LZ des protéines humaines C-MYC et MAX

Abstract

L'onco-protéine c-Myc est un facteur de transcription de type b-HLH-LZ"basic-Helix-Loop-Helix-Leucine Zipper" qui fait partie du réseau de facteur de transcription Myc/Max/Mad. Sous la forme d'hétérodimère avec Max (son partenaire obligatoire), c-Myc peut activer et réprimer la transcription. c-Myc est surexprimé dans les cellules cancéreuses et active la transcription de gènes essentiels à la croissance et la prolifération cellulaire et réprime les gènes menant à la différentiation et l'arrêt du cycle cellulaire. Le b-HLH-LZ de c-Myc fut démontré comme critique à la fois pour la transactivation en complexe avec l'ADN, de même que pour la transrépression suite à la formation d'un complexe avec la protéine Miz-l. On dénombre actuellement plus de 1500 gènes dont la transcription est régulée par c-Myc. La caractérisation de la dynamique de reconnaissance moléculaire des b-HLH-LZs de c-Myc et Max (étape initiale des fonctions cellulaires de c-Myc) est donc primordiale à la compréhension des mécanismes permettant l'édification et la suppression des complexes supérieurs d'activation et de répression de la transcription par c-Myc. Dans le cadre de cette étude, nous avons cloné, surexprimé et purifié le domaine b-HLH-LZ de la protéine c-Myc humaine, uniformément marqué [indice supérieur 13]C et [indice supérieur 15]N, et avons formé son complexe hétérodimérique/hétéroisotopique avec le b-HLH-LZ de Max produit en abondance naturelle. Nous avons confirmé l'hétérodimérisation spécifique par dichroïsme circulaire (CD) et résonance magnétique nucléaire (RMN), et nos résultats montrent que le complexe c-Myc/Max est replié convenablement en absence d'ADN et lie de façon dimérique les cibles E-box. Nous montrons aussi que l'hétérodimérisation est optimale à pH 4.8 et inexistante à pH acide 2.8. Tel que discuté dans l'article joint, ces résultats suggèrent que des résidus glutamates sur c-Myc et une histidine sur Max sont impliqués dans l'hétérodimérisation spécifique. Pour réaliser une analyse thermodynamique adéquate du système dissociatif de c-Myc et Max, nous avons développé une nouvelle approche computationnelle qui permet d'estimer les populations simultanées d'hétérodimère et d'homodimère à partir de dénaturations thermiques suivies par CD. Tel qu'anticipé, nous montrons avec cette approche qu'une population d'homodimère Max/Max compétitionne avec l'hétérodimère en solution. Pris dans leur ensemble, nos résultats représentent la caractérisation la plus complète à ce jour de l'hétérodimérisation spécifique entre c-Myc et Max et mettent en relief la possibilité de l'existence d'une population non négligeable d'homodimère Max/Max in vivo