Reduction of lipopolysaccharide content and detoxification in Bordetella pertussis and Bordetella bronchiseptica

Abstract

O género Bordetella é composto por múltiplas bactérias que causam doenças a nível respiratório. Pertússis, ou tosse convulsa, é causada pelo patogénico humano Bordetella pertussis, enquanto Bordetella bronchiseptica afeta uma ampla variedade de mamíferos, mas raramente humanos. Embora raramente sejam infetados, a transmissão ocasional em humanos ocorre geralmente em indivíduos imunocomprometidos. Estirpes de B. bronchiseptica isoladas de diferentes espécies hospedeiras possuem características genéticas e fenotípicas únicas. Infeção por esta bactéria predispõe o animal à colonização por outros patogénicos. Ambas as espécies demonstram uma associação clara com a idade. Na indústria suína, B. bronchiseptica afeta amplamente as populações de jovens leitões enquanto nos humanos a morbidade e mortalidade são mais graves em crianças infetadas com B. pertussis. Antes da introdução das primeiras vacinas contra a tosse convulsa, esta doença era uma das principais causas de morte. A primeira geração de vacinas desenvolvida na década de 1950 é composta de células não viáveis do patogénico. As severas reações adversas provocadas pela administração destas vacinas levaram ao desenvolvimento das vacinas de segunda geração, ou acelulares. Integram estas vacinas componentes bacterianos purificados. Indivíduos vacinados com vacinas acelulares apresentam rápido declínio da imunidade e podem ser portadores assintomáticos. A imunização contra B. bronchiseptica, tanto de células não viáveis quanto acelulares, foi considerada parcialmente ineficaz ou segura para os animais. O lipopolissacarídeo (LPS) ou lipoglicano é o principal responsável pelas reações adversas das vacinas de primeira geração. O LPS é um dos principais componentes da membrana externa das bactérias Gram-negativas e constitui a camada externa da membrana externa. O LPS contribui para a assimetria lipídica na membrana externa, oferecendo uma barreira de permeabilidade eficiente a antimicrobianos e outros fatores de stress. A toxicidade do LPS deriva da sua parte lipídica, denominado lípido A. A biossíntese do lípido A, ou via de Raetz, inclui nove etapas conservadas catalisadas por enzimas. Esta via tem início com a acilação de UDP-N-acetilglucosamina (UDPGlcNAc) pela enzima LpxA e subsequente desacetilação pela enzima LpxC. A LpxC é uma enzima dependente de zinco que se correlaciona diretamente com a quantidade de LPS presente na membrana externa. Nas espécies de Bordetella a estrutura do lípido A é completada após a introdução de cadeias acil secundárias catalisadas pelas aciltransferases LpxL1 e LpxL2 na cadeia acil primária. O número de cadeias acil é determinante na atividade endotóxica da bactéria. A enzima LpxL1 não é normalmente expressa em B. pertussis, resultando numa estrutura com cinco cadeias acil. Em B. bronchiseptica a expressão de ambas as enzimas resultam em seis cadeias acil no lípido A distribuídas de forma irregular e produzindo uma estrutura assimétrica. O LPS é transportado através da membrana interna pelo transportador ABC (cassete de ligação de ATP) MsbA e posteriormente para a camada externa da membrana externa pela maquinaria de transporte do LPS (Lpt). O transporte mediado pelo MsbA é específico para a acilação do lípido A e a sua depleção leva à acumulação de LPS e glicerofosfolípidos na membrana interna da bactéria. A superexpressão deste gene essencial mostrou compensar a inativação do gene lpxL no crescimento de E. coli e Burkholderia cenocepacia. Múltiplos mecanismos foram identificados em bactérias Gram-negativas para preservar a assimetria lipídica na membrana externa. Perturbações da membrana ou rutura da biossíntese do LPS ou do seu sistema de transporte causam uma inversão compensatória de fosfolípidos para a camada externa da membrana externa de forma a acomodar a redução nos níveis de LPS. A fosfolipase PldA atua como um sensor de assimetria lipídica na membrana externa, degradando fosfolípidos que destabilizam a homeostasia. Os ácidos gordos produzidos pela hidrólise dos fosfolípidos sinalizam para a inibição da degradação da enzima LpxC e consequente aumento do LPS. O sistema de transporte ABC, Mla, facilita o transporte retrógrado de fosfolípidos de volta para a membrana interna. Esta via é regulada positivamente após a perda de LPS. Mutações que resultam na perda de função de qualquer um dos genes que codificam o transportador Mla afetam toda a via, levando à rutura do equilíbrio lipídico na membrana externa e à acumulação de fosfolípidos na superfície celular. Após a interrupção dos níveis de LPS, a remoção destes dois sistemas permite que a membrana externa recupere a homeostasia entre as camadas da bicamada lipídica. Exemplos de bactérias Gramnegativas capazes de sobreviver na ausência de lípido A são Acinetobacter baumanni, Neisseria meningitidis e Moraxella catarrhalis. Existe a necessidade de vacinas mais seguras e eficientes para B. bronchiseptica e B. pertussis. As vacinas acelulares são menos reativas do que as vacinas de células não viáveis devido à quantidade mínima ou inexistente de LPS. O objetivo deste estudo foi aplicar o mesmo princípio numa vacina com células não viáveis. Reduzir a quantidade de LPS e a sua endotoxicidade em ambas as espécies envolveu a interferência na biossíntese e estrutura do lípido A, com a suposição de que menos LPS e lípido A com menos cadeias acil traduzem em bactérias menos endotóxicas. A produção das enzimas-chave da síntese, LpxA, LpxC, LpxL1 e LpxL2 foi interrompida ou regulada com promotores induzíveis. A interferência com as duas primeiras enzimas afeta a quantidade de lípido A produzido. A inativação do gene lpxA por meio da introdução de um marcador antibiótico foi combinada com um plasmídeo de expressão contendo o gene expresso a partir de um promotor controlável. A construção do vetor contendo o gene lpxA interrompido pela sequência de resistência ao antibiótico cloranfenicol falhou pois não foi possível introduzir a sequência de resistência ao antibiótico no vetor. O principal desafio foi conseguir transformantes resistentes a cloranfenicol. A mesma estratégia foi usada para os genes lpxL1 e lpxL2 em simultâneo (lpxL1-2) e lpxL2 em diferentes estirpes de Bordetella. A inativação de lpxL1-2 foi também tentada na estirpe deficiente B. pertussis ΔPdlA-MlaF usando um vetor suicida para recombinação homóloga e troca alélica. A estirpe mutante permite que a célula atinja a homeostasia quando a estrutura de LPS é deficiente em cadeias acil. A inativação de lpxL1-2 no cromossoma foi efetuada com a colaboração de uma cópia dos genes sob um promotor induzível num plasmídeo fora do cromossoma. O mutante não apresentou diferenças de crescimento em comparação com a estirpe selvagem (WT). A estrutura do LPS divergiu do controlo WT apresentando uma cadeia acil suplementar. Numa abordagem diferente, a expressão dos genes lpxC e lpxL2 foi regulada por meio de um promotor controlável inserido no cromossoma, todavia a inserção cromossómica foi inexequível.Bordetella species cause respiratory diseases in several animals. Pertussis, or whooping cough, is caused by the human pathogen Bordetella pertussis, while Bordetella bronchiseptica affects a broad range of mammals, but rarely humans. Severe morbidity and mortality in young children caused by B. pertussis led to the development of wholecell vaccines. The reactogenicity of the vaccine produced several side effects that later led to development of second-generation acellular vaccines. Individuals vaccinated with acellular vaccines present a rapid waning of immunity and can be asymptomatic carriers. Immunization against B. bronchiseptica, either whole-cell or acellular, has been regarded as not fully effective or safe for the animals. The lipopolysaccharide (LPS) is the main reason for the high reactogenicity of the firstgeneration vaccines. LPS is one of the main components of the outer membrane of Gramnegative bacteria. LPS contributes to the lipid asymmetry in the outer membrane offering an efficient permeability barrier to antimicrobials and other stressors. LPS endotoxicity derives from its lipid A moiety. This study aimed to reduce the LPS amount and endotoxicity in the bacterial cell through reduction of lipid A biosynthesis or by modifying its structure, with the assumption that less LPS and less-acylated lipid A translates in cells with reduced endotoxicity. Interference with lipid A biosynthesis and structure involved the inactivation of the lpxA, lpxL2 and lpxL1 and lpxL2 genes simultaneously and chromosomal regulation of the expression of the lpxC and lpxL2 genes. Constructs were created for the insertion of an inducible promoter that would allow for the regulation of lpxC and lpxL2 expression. However, the chromosomal insertion was unfeasible. Chromosomal knock-out with a copy under an inducible promoter on a plasmid did not present fitness differences compared to the wild-type (WT) strain. LPS structure diverged from the WT control and presented hexa-acylated lipid A.Project under the BacVactory program - A Technology Center for Bacterial Vaccines – on Whole-cell and outer-membrane-vesicle vaccines under supervision of Prof. dr. J.P.M. Tommassen at Utrecht University, Faculty of Science, Biology Department, Utrecht, The Netherlands. Financial support for mobility granted by Erasmus