Aquaculture industry has a huge contribution for the world food production, and is extremely necessary to develop and optimize the production techniques, especially not to depend totally on wild stocks. In the case of the sea urchin Paracentrotus lividus, the demand increase of their roe is provoking a drastically decrease of their wild stocks, particularity in the recent years. This demand for sea urchin roe is arousing interest for the industry for a new profitable product and for the recovering and preserve wild populations. In this sense, new research needs to guarantee optimization of the techniques used to reduce the effort and the production cost. The selection of breeders is a very important aspect for sea urchin industry, since the success of the reproduction and quality of their product are dependent of the breeders. In addition to the high cost of acquiring wild specimens, it is not viable in the long term. Therefore, is important to study the possibility of use breeders from captive generations. The optimization of in vitro reproduction techniques is crucial for an efficiency production. The time that gametes need to be in contact for the best fertilization rate and the ratio of spermatozoa per oocyte are two of the principal aspects to be considered in an optimization of an in vitro reproduction protocol. Through preservation and cryopreservation technology is possible to promote alternatives techniques to contribute for the resource management efficiency of P. lividus. The objectives of this work are to study the hypothesis of using male wild sea urchins from different locations and captive generations specimens as breeders, optimize in vitro protocols using different contact times and different spermatozoa to oocyte ratio, and compare cryopreservation and preservation techniques for the storage of the sperm. To study the possibility of use captive generations as breeders were evaluated the sperm quality of each case, for this evaluation were analyzed the viability and motility, being used two approaches for the last one (mean values and subpopulation). The optimization of fertilization outcomes was evaluated counting the number of fertilized eggs using a counting chamber (Sedgwick) in optical microscope. Moreover, the comparation of the preservation and cryopreservation techniques was analyzed the motility by mean values, viability and DNA fragmentation (comet assay). The motility analysis were assessed by CASA system, viability through staining techniques and counting at a fluorescent microscope, DNA fragmentation was quantified the DNA tail. Significant differences were observed (p<0.05) in breeders selection, revealing the domestication seems to have a positive effect in P. lividus sperm quality. The in vitro spermatozoa to oocyte ration trial reveled significant differences between all ratios, where the 20 000 spermatozoa to oocyte ratio had the higher value. Contact times chosen differed negatively from the control. The preservation technique had higher viability in the first 6 days comparing to cryopreservation, although had no damage in DNA were detected in both. The present study revealed that domestication seems to be a good step to optimize the breeders sperm quality. With the higher spermatozoa to oocyte ratio used is possible to reach almost the total egg fertilization percentage. The preservation at 4ºC is a good technique to preserve the sperm quality until 6 days, cryopreservation seems to be better from there if the protocol is optimized.A indústria de aquacultura tem uma enorme contribuição para a produção de alimentos a nível mundial, e é extremamente necessário para desenvolver e otimizar as técnicas de produção, especialmente para não depender totalmente nos stocks selvagens. No caso do ouriço do mar Paracentrotus lividus, o aumento da procura das suas ovas tem provocado uma descida drástica dos stocks selvagens, particularmente nos últimos anos. Esta procura pelas ovas de ouriço do mar tem despertado o interesse da indústria para a produção de um novo produto lucrativo e para a recuperação e preservação das populações selvagens. Neste sentido, os futuros estudos devem garantir a otimização das técnicas usadas para reduzir o esforço e o custo da produção. A seleção dos progenitores é um aspeto muito importante para a indústria do ouriço do mar, visto que o sucesso da reprodução e a qualidade do produto final é dependente dos mesmos. Além do elevado custo da aquisição de espécimes selvagens, não é viável a longo termo a sua captura no meio natural. Portanto, o estudo da possibilidade de utilizar progenitores descendentes dos reproduzidos em cativeiro é bastante importante. A otimização das técnicas de reprodução in vitro é crucial para uma reprodução eficiente. O tempo que os gametas necessitam de estar em contacto para a melhor taxa de fertilização e o rácio de espermatozoides por oócito são dois dos principais aspetos a considerar na otimização de um protocolo de reprodução in vitro. Através de tecnologias de criopreservação e preservação é possível utilizar técnicas alternativas que podem contribuir para um maneio de recursos mais eficiente no caso do P. lividus. Os objetivos deste trabalho englobam o estudo da hipótese do uso de espécimes de ouriços do mar macho capturados em diferentes localizações geográficas e gerações de cativeiro como progenitores, otimização de protocolos in vitro usando tempos de contato e rácios espermatozoide para oócito diferentes, e comparar técnicas de criopreservação e preservação para o armazenamento do sémen. Para estudar a possibilidade do uso de espécimes selvagens e de diferentes gerações de cativeiro como progenitores foi avaliada a qualidade do sémen de cada caso, nesta avaliação foi analisada a viabilidade e a motilidade dos espermatozoides, tendo sido usadas duas abordagens diferentes para a última (valores médios e subpopulações). A otimização das técnicas de fertilização foi avaliada através da contagem do número de ovos fertilizados usando uma camara de contagem (Sedwick) num microscópio ótico. Por fim, na comparação das técnicas de criopreservação e preservação foi analisada a motilidade através de valores médios, a viabilidade e a fragmentação do ADN (teste de cometas). A análise da motilidade foi efetuada usando o sistema CASA (Computer-assisted sperm analysis), viabilidade através de técnicas de coloração fluorescente e contagens num microscópio de fluorescência, a fragmentação do ADN avaliada através da quantificação cauda do ADN. Foram observadas diferenças significativas (p<0.05) na seleção dos progenitores, revelando que a domesticação parece ter um efeito positivo na qualidade do sémen de P. lividus. Os ensaios in vitro com diferentes rácios de espermatozoide por oócito mostraram diferenças significativas em todos os rácios, sendo que o rácio de 20 000 espermatozoides por oócito teve a maior percentagem de fertilização. Os tempos de contacto escolhidos diferenciaram negativamente do controlo. Comparando com a técnica de criopreservação, a técnica de preservação teve maior viabilidade nos primeiros 6 dias, no entanto não foi detetado nenhum dano no ADN em ambas as técnicas. Este trabalho revelou que a domesticação parece ser um bom passo para a otimização da qualidade do sémen dos progenitores de P. lividus. Com o maior rácio de espermatozoides por oócito foi possível atingir quase a percentagem total de ovos fertilizados. A preservação a 4ºC é uma boa técnica para preservar a qualidade do sémen até aos 6 dias, depois deste tempo, a criopreservação parece ser melhor, contundo o protocolo necessita de ser otimizado.Queria expressar o meu agradecimento a alguns projetos que foram fundamentais para a realização deste trabalho. Dois projetos da EPPO (Estação Piloto de Piscicultura de Olhão /IPMA - Instituto Português do Mar e da Atmosfera), OURIÇAQUA (FA_05_2017_009) e DIVERSIAQUA II (MAR2020-P02M01-0656P), e ao projeto do Centro de Ciências do Mar (CCMAR), Universidade do Algarve denominado por EBB European Blue Biobank (EBB-EAPA_501/2016 (Interreg Atlantic Area)
