Tetraselmis sp. CTP4 was selected from a bioprospection screening as a promising candidate for industrial cultivation and exploitation of different biotechnological applications. At lab-scale, several experiments revealed that this strain is highly robust to environmental conditions, has the ability to accumulate significant amounts of lipids under nitrogen depletion, displays also high growth and sedimentation rates. In collaboration with Allmicroalgae (Algafarm, Secil, Leiria, Portugal), experiments at industrial-scale in 100-m3 tubular photobioreactors showed that this strain is able to attain promising areal productivities, remaining a monoalgal culture throughout the whole trial. Thereafter, a low-cost pilot-scale harvesting system enabled the recovery of 97% of the total biomass by natural sedimentation, reducing the harvesting costs by 93%. Biochemical characterization of industrially produced biomass revealed a high content of proteins and dietary fibres as well as interesting levels of chlorophyll, carotenoids and vitamins, whereas microbial pathogens and contaminants analysed were absent from the biomass. Later, upon the development of a biorefinery platform, the wet biomass was extracted with ethanol and fractionated using a liquid-liquid triphasic system, leading to four different streams: non-polar (NP), colloidal (CP) and water (WP) phases as well as the residual biomass (RB) leftover of the ethanolic extraction. The CP was characterized as a source of high value molecules, while the NP, WP and RB were successfully upgraded into biodiesel, bioethanol and biogas, respectively. The RB was also tested as an ingredient for juvenile seabream, showing to be a promising substitute to replace soybean meal in aquafeeds. Overall, Tetraselmis sp. CTP4 was successfully produced at industrial scale, a low-cost harvesting system was established, and the produced biomass had a promising composition suitable for prospective nutritional applications. In addition, the biorefinery approach implemented led to the production of different streams that were effectively upgraded into different bioproducts, namely biofuels and aquaculture feed.No âmbito de um esforço de bioprospeção de novas microalgas para desenvolvimento biotecnológico realizado pelo grupo MarBiotech (Centro de Ciências do Mar, Universidade do Algarve), a estirpe Tetraselmis sp. CTP4 foi selecionada para o cultivo de biomassa à escala industrial e exploração de diferentes aplicações biotecnológicas. À escala laboratorial, ensaios preliminares revelaram que esta estirpe apresenta elevada taxa de crescimento e robustez para tolerar diversas condições ambientais. Adicionalmente, esta estirpe tem a capacidade de acumular quantidades significativas de lípidos, que podem chegar a 33% do peso seco da biomassa produzida, quando as culturas são submetidas a limitação de azoto no meio de crescimento. Estes ensaios revelaram também que a Tetraselmis sp. CTP4 apresenta uma composição lipídica muito interessante, e que após a conversão da fração de lípidos em biodiesel, as propriedades do biocombustível produzido estão dentro dos parâmetros regulados pelas normativas europeia e americana.
Dado o elevado potencial desta microalga, foi estabelecida uma colaboração com a Allmicroalgae (Algafarm, grupo Secil, Leiria, Portugal), a maior unidade de produção de microalgas em sistemas fechados da Europa, para avaliar o crescimento das culturas desta estirpe em condições exteriores, utilizando fotobiorreatores tubulares industriais com um volume de 100 m3. Os ensaios realizados no exterior mostraram que foram necessárias oito semanas para realizar o aumento de escala de uma placa de agar até aos reatores de produção industrial. Durante o aumento de escala, realizou-se a otimização da produção em sistemas tubulares à escala piloto. Esta otimização mostrou melhores produtividades de biomassa quando a velocidade de cultura se encontra entre 0,65 a 1,35 m/s e com o valor de pH de 8,0 para injeção de CO2 na cultura. À escala industrial, verificou-se uma adaptação imediata das culturas aos sistemas de produção tubulares com produtividades areais muito promissoras (10-20 g/m2/d) e elevada eficiência fotossintética (3,5% da irradiância solar total), sendo possível manter uma cultura monoalgal durante todo o período de produção (60 dias). A sequestração de CO2 foi seguida no fotobiorreator de 100 m3, revelando uma eficiência média de mitigação de CO2 de 65% e uma relação de biomassa/carbono de 1,8.
Posteriormente, foi desenvolvido um sistema de colheita piloto de baixo custo da biomassa de Tetraselmis sp. CTP4, nas instalações da Algafarm. Para este fim, adaptou-se um tanque cilindro-cónico para recolher a biomassa através da sedimentação natural das células sem custos energéticos. Os ensaios mostraram que após se introduzir a cultura no tanque, as células conseguem sedimentar na parte inferior do tanque após 24 horas, sendo possível recolher o meio de cultura pelas entradas laterais do sistema. Através do processo desenvolvido é possível recuperar 97% da biomassa total por sedimentação natural, sendo que se perdem apenas 3% com a remoção do meio de cultura do sistema. Usando esta abordagem, 93% do volume total da cultura é recuperado do tanque, com um peso seco de 0,07 g/L, o que representa uma redução muito significativa dos custos associados à colheita da biomassa. A restante cultura (7%) é recuperada na forma de uma cultura concentrada e pasta húmida de microalgas com pesos secos aproximados de 20 e 273 g/L, respetivamente.
Na fase seguinte, pretendeu-se avaliar o potencial nutricional da biomassa de Tetraselmis sp. CTP4 produzida em fotobiorreatores industriais (100 m3). Para este fim, realizou-se uma avaliação minuciosa da composição bioquímica, microbiológica e toxicológica da biomassa. As análises efetuadas mostraram que a biomassa contém elevadas quantidades de proteína (31,2 g/100 g), fibras alimentares (24,6 g/100 g), glícidos digestíveis (18,1 g/100 g) e cinzas (15,2 g/100 g), mas com baixo conteúdo lipídico (7,04 g/100 g). A biomassa apresentou ainda níveis interessantes de clorofila (3,5 g/100 g), carotenóides (0,61 g/100 g) e vitaminas (por exemplo, 79,2 mg de ácido ascórbico/100 g) e atividade antioxidante. Por outro lado, bactérias patogénicas, metais pesados, cianotoxinas, micotoxinas, hidrocarbonetos aromáticos policíclicos e pesticidas não foram detetados na biomassa produzida. De um modo geral, a biomassa produzida tem uma composição promissora para aplicações nutricionais em humanos e animais.
Subsequentemente, pretendeu-se desenvolver um novo método de processamento da biomassa tendo em conta o conceito de biorrefinaria, de modo a rentabilizar ao máximo todos os componentes bioquímicos presentes na biomassa de Tetraselmis sp. CTP4, para produzir diferentes bioprodutos. Neste contexto, realizou-se uma extração com etanol diretamente da biomassa húmida e o extrato resultante foi fracionado usando um sistema trifásico líquido-líquido (LTPS). No final deste processo, a partir da biomassa, obtiveram-se 4 frações distintas, nomeadamente as frações não polar (NP), coloidal (CP) e aquosa (WP), obtidas a partir do extrato etanólico, e a biomassa residual (RB) remanescente da extração etanólica. A fração CP foi caracterizada como fonte de moléculas de valor acrescentado, devido à presença de fosfolípidos e carotenóides, que apresentam uma elevada aplicabilidade para diferentes indústrias. As frações NP, WP e RB foram convertidas com sucesso em diferentes biocombustíveis, nomeadamente, biodiesel, bioetanol e biogás, respetivamente.
No final desta dissertação, foi ainda realizado um ensaio em colaboração com a Sparos Lda. para testar a biomassa residual como um ingrediente para rações de aquacultura. Neste contexto, foi realizado um ensaio para avaliar o efeito de uma incorporação de 10% de biomassa residual de Tetraselmis sp. CTP4, em substituição da farinha de soja em juvenis de dourada (Sparus aurata). O ensaio foi realizado durante 61 dias e mostrou que os critérios gerais de desempenho (peso corporal final, índice de crescimento diário, taxa de conversão alimentar e taxa de eficiência proteica), composição corporal total e retenção de nutrientes não foram significativamente afetados pela introdução da biomassa residual. No entanto, a dieta com biomassa residual apresentou valores significativamente superiores nos coeficientes de digestibilidade aparente (ADC) de proteína, energia e fósforo, comparativamente à dieta com farinha de soja. No final, um teste de confinamento agudo mostrou uma resposta de cortisol significativamente menor nos peixes alimentados com a dieta com biomassa residual (120 ± 23 ng/mL) do que naqueles alimentados com a dieta com farinha de soja (160 ± 33 ng/mL). Os resultados gerais mostraram que a biomassa residual de Tetraselmis sp. CTP4 pode reduzir as elevadas necessidades de farinha de soja em alimentos para a aquacultura como atualmente se verifica.
Em conclusão, a estirpe Tetraselmis sp. CTP4, foi produzida com sucesso à escala industrial, o sistema de recolha de biomassa de baixo custo foi efetivamente estabelecido e a biomassa produzida revelou um alto potencial para aplicações nutricionais. Além disso, a metodologia desenvolvida para o processamento da biomassa tendo em conta o conceito de biorrefinaria, permitiu a produção de diferentes frações que foram posteriormente convertidas em diferentes bioprodutos, nomeadamente biocombustíveis e rações para aquacultura.The author acknowledges the Portuguese Foundation for Science and Technology (FCT) for funding the PhD fellowship (Grant SFRH/BD/105541/2014
