Breast Cancer (BC) is the most common cancer among women worldwide.
However, the current knowledge of BC susceptibility only accounts for half of the
familial cases. The few functional studies performed for genome-wide association
studies (GWAS) loci revealed a role for cis-regulatory variation, suggesting that
risk variants may be acting by regulating gene expression levels. Therefore, we
hypothesise that the most efficient approach to tackle BC missing heritability is to
focus susceptibility studies on variants with greater cis-regulatory potential.
Hereby, we present an innovative approach to genetic association studies, using a
quantifiable readout of the effect of cis-regulatory variants — differential allelic
expression (DAE).
To identify candidate risk genes for our study, we selected Single Nucleotide
Polymorphisms (SNPs) weakly associated with BC risk in GWAS and in the iCOGS
consortium and identified their proxy SNPs. The resulting 591 candidate risk
variants were located in 92 different genes, of which 41 had evidence of being cisregulated
in a DAE study of normal breast tissue. The clinical impact of these
genes was assessed, for a diverse list of clinical variables (differential expression
analysis, FDR ⩽ 1% and absolute fold-change ⩾1.5). A final list of 18 risk
candidates cis-regulated and with clinical impact genes was identified.
OCIAD1 and GRHL2 genes were selected to perform case-control
association studies using DAE values. DAE of OCIAD1 was significantly associated
with BC risk (p-value=0.002 and 0.008, in two independent experiments using
blood samples), while DAE of GRHL2 needs further validation of association (pvalue=
0.014 and 0.096, in two independent experiments in breast tissue).
This project proved that association studies using DAE as a quantifiable
variable, together with the whole pipeline used to select the candidate genes, is an
efficient approach to detect novel risk genes for BCO cancro da mama é o tipo de cancro mais diagnosticado em mulheres,
tanto em países desenvolvidos como em países em vias de desenvolvimento,
representando 25% de todos os cancros mais diagnosticados. É uma doença
caracterizada pelo crescimento anormal de células da mama conduzindo à
formação do tumor. Esta neoplasia pode ser classificada segundo a sua morfologia
e histologia básica, mas também a nível molecular. Trata-se de uma doença
complexa, com uma componente genética e ambiental. Os fatores de risco para
desenvolvimento de cancro da mama podem ser modificáveis, como é o caso da
diminuição do contacto com radiação ionizante, consumo de hormonas femininas
exógenas, entre outros, mas também existem fatores não modificáveis como é o
caso da genética e da herança familiar. Cerca de 10-30% dos cancros da mama
estão relacionados com fatores hereditários e dentro destes, entre 5-10% dos casos
têm uma forte componente herdada. Os alelos genéticos podem ser categorizados
de acordo com o risco e com a sua frequência na população, em alelos de alto risco,
como é o caso de mutações nos genes BRCA1/BRCA2, alelos de risco moderado,
como as mutações em ATM e BRIP1 e em alelos que conferem baixo risco na
população, como o caso dos polimorfismos genéticos identificados nos genes
FGFR2 e TOX3. No entanto cerca de metade da componente de risco familiar para
o cancro da mama permanece por identificar.
Os estudos de associação do genoma (GWAS) permitiram a identificação de
muitos alelos de risco sem conhecimento prévio da posição ou função do gene.
Estes estudos em cancro da mama revelaram que os polimorfismos de variante
única (SNPs) associados a risco para a doença estão presentes maioritariamente
em regiões não codificantes e os poucos estudos funcionais realizados nestes loci
mostraram que variantes cis-reguladoras causavam risco através da regulação da
expressão genética. As variantes em cis alteram a síntese dos transcritos de forma
específica para cada alelo, podendo estar localizadas em regiões promotoras do
gene, enhancers, bem como a centenas de kilobases (kb) de distância. A medição
do rácio de expressão do RNA entre os dois alelos permite a deteção direta do
efeito destas variantes, designando-se por análise de expressão alélica diferencial
(DAE). Posto isto, sugere-se que para identificar novas variantes associadas a risco
para cancro da mama deve-se focar os estudos em variantes cis-regulatórias e
propõe-se utilizar rácios de DAE como medida quantitativa em estudos de
associação genética.
Para selecionar os genes candidatos para serem testados nos estudos de
associação usando níveis de DAE usou-se a seguinte abordagem: primeiro
identificaram-se 608 variantes candidatas a conferir risco para cancro da mama,
uma vez que mostraram evidência de estarem associadas com risco para cancro da
mama, mas não atingiram significância estatística nos GWAS. Estas variantes e os
seus proxy SNPs (r2 ≥ 0.8) estavam localizadas em 92 genes diferentes. Visto que
se pretendia selecionar genes para validação no laboratório que tivessem cisregulados,
filtrou-se os 92 genes candidatos a risco com os dados de DAE do grupo
(que indicavam quais os genes com evidência de cis-regulação), ficando-se com 41
genes cis-regulados e com evidência de poderem contribuir para risco de
desenvolver cancro da mama. Com o objetivo de se selecionarem genes com
possível impacto clínico, realizaram-se análises de associação estatística entre
expressão genética no genoma inteiro (derivada de microarrays de ácido
desoxirribonucleico complementar (cADN) e diferentes variáveis clínicas (recetor
de estrogénio, recetor de progesterona, grau, entre outras). Com esta análise de
expressão diferencial verificou-se que 18 dos genes anteriores possuíam impacto
clínico em pelo menos uma das análises consideradas (p-value≤0,01 (1% False
Discovery Rate correction) e |Fold Change|≥ 1,5) e foram estabelecidos os genes
finais de interesse. Destes 18 genes, selecionaram-se dois para a realização do
estudo caso-controlo, com base nas evidências de DAE das análises efetuadas no
grupo anteriormente, na significância estatística para o risco observada nas
primeiras fases dos GWAS, no impacto clínico verificado nas análises de expressão
diferencial, na frequência do alelo mais raro do SNP localizado nesse gene), na
expressão total dos transcritos no tecido saudável da mama, bem como na
presença de expression quantitative trait loci para o SNP transcrito (tSNP) de
cada gene candidato. Após esta análise o gene OCIA domain containing 1
(OCIAD1), e nomeadamente o seu tSNP rs9997920 (alelos C/T (minor)), assim
como o Grainyhead Like Transcription Factor 2 (GRHL2) e o seu tSNP
rs6989650 (alelos C/T (minor)) foram selecionados para realização dos estudos caso-controlo, tendo sido o OCIAD1 testado em tecido da mama e no sangue e o
GRHL2 apenas em mama.
Para cada estudo caso-controlo foi incorporada uma curva de calibração
com uma amostra heterozigótica de modo a quantificar-se de forma precisa o DAE
e uma curva standard com amostras heterozigóticas com os dois alelos em
diferentes proporções para servir de controlo positivo. Os estudos de associação
revelaram que no gene OCIAD1 no sangue existe uma diferença significativa entre
os níveis de DAE nos casos e dos controlos (p-value= 0.002 e 0.008 em duas
experiências independentes), tendo o alelo menos frequente do rs9997920 uma
maior expressão nos casos do que nos controlos. No tecido mamário não se
verificou esta diferença nos níveis de DAE do OCIAD1 (p-value= 0.4 e 0.07 para a
segunda experiência), o que nos leva a concluir que apenas o sangue poderá ser
usado para inferir o risco conferido por este gene. No entanto, e uma vez que os
coortes populacionais do sangue são diferentes dos do tecido, este estudo deveria
ser repetido usando sangue e tecido das mesmas pessoas. O estudo de associação
genética para o GRHL2 revelou que este é um potencial gene de risco para cancro
da mama uma vez que apresentava níveis de DAE diferentes entre casos e
controlos no tecido da mama, mas apenas numa das experiências realizadas
(=0,014 e 0.096 para a segunda experiência). Verificou-se que o alelo comum do
rs6989650 está mais expresso nos casos do que nos controlos o que nos leva a
concluir que este possivelmente é o alelo de risco, mas mais estudo têm que ser
feitos para garantir que realmente a presença desta variante leva a risco para o
desenvolvimento da doença.
Este estudo permitiu a identificação de potenciais novos genes associados a
suscetibilidade para cancro da mama, e gerou uma lista de novos genes candidatos
para serem testados no futuro para associação com cancro da mama, através da
análise de DAE. Futuras repetições das experiências têm que ser realizadas para
garantir que o OCIAD1 e o GRHL2 são genes de risco para cancro da mama. Ao
confirmarem-se, mais estudos deverão ser feitos de modo a identificar as variantes
causais bem como o mecanismo pelo qual estarão a provocar o risco
