Optimization of in vitro fertilization using cryopreserved sperm of Crassostrea angulata and establishment of a cryopreservation protocol for Chamelea gallina
The development of methods that allow the conservation of genetic resources as sperm cryopreservation are necessary to avoid the pressure on the natural populations and the risk of extinction of Crassostrea angulata and Chamelea gallina, improving the reproductive strategies for eventually restocking programs and even aquaculture production with commercial purposes. Therefore, this work aimed to optimize the cryopreservation protocol for C. angulata testing different combinations of cryoprotectants, to assess the fertilization conditions for oyster and to assess the sperm quality parameters before and after exposure of C. gallina sperm to cryoprotectants solutions, determining the best cryopreservation conditions in terms of freezing rates. For optimization of a cryopreservation protocol for C. angulata, motility, viability and DNA integrity analysis were performed for cryopreserved sperm with dimethyl sulfoxide (DMSO), DMSO+trehalose and DMSO+sucrose. Fertilization trials with different sperm-to-egg ratios and volumes were tested and the success of fertilization trials was determined. For the assessment of sperm quality parameters of C. gallina, toxicity tests and cryopreservation assays were performed. For toxicity tests, fresh sperm was exposed to cryoprotectants (DMSO, ethylene glycol and methanol) and motility analysis were recorded. For cryopreservation assays, the same cryoprotectant conditions and two freezing rates were analysed. Motility and viability analysis were performed in post-thaw sperm. Supplementation of DMSO with sugars did not optimize motility, viability or decrease DNA fragmentation in Crassostrea angulata sperm. In fertilization trials, the best sperm-to-egg ratio using post-thawed sperm was 50,000 spermatozoa per egg. Trehalose did not improve the fertilization rate and no effect of fertilization volume was seen between different volumes. For Chamelea gallina, the toxicity trials demonstrated that DMSO was the most suitable cryoprotectant. However, post-thawed sperm showed no motility but DMSO showed the higher viability results, being the best conditions for sperm cryopreservation achieved with the fastest freezing rate. More studies are necessary to develop successfully a cryopreservation protocol for C. gallina.O desenvolvimento de métodos que permitam a conservação dos recursos genéticos, tais como a criopreservação de sémen, é necessário de modo a evitar a pressão exercida sobre as populações naturais e diminuir o risco de extinção de ostra portuguesa (Crassostrea angulata) e de pé-de-burrinho (Chamelea gallina). Estes métodos permitem melhorar as estratégias reprodutivas destas espécies permitindo eventuais programas de repovoamento e ainda a produção em aquacultura com fins comerciais. Portanto, a realização deste trabalho teve como objetivos a otimização do protocolo de criopreservação para a C. angulata testando diferentes combinações de crioprotetores internos e externos e avaliar as condições de fertilização desta espécie em condições experimentais. Outro dos objetivos foi avaliar os parâmetros de qualidade do sémen para a C. gallina antes e depois de ser exposto às soluções de criopreservação (crioprotetores) e determinar as melhores condições de criopreservação em relação a rampas de congelação. Para a otimização do protocolo de criopreservação de C. angulata, foram realizadas análises de mobilidade, viabilidade e de integridade de DNA (cometas) em sémen criopreservado com dimetilsulfóxido (DMSO) e duas combinações de DMSO com açucares (DMSO+trealose e DMSO+sacarose). Para esta espécie foram também realizados ensaios de fertilização onde foram testados diferentes rácios de espermatozóides por ovo e diferentes volumes de fertilização. Com isto, foi calculada uma taxa de fertilização para determinar o sucesso destes ensaios. Na avaliação dos parâmetros de qualidade de sémen de C. gallina, foram realizados testes de toxicidade e ensaios de criopreservação. Nos testes de toxicidade, o sémen fresco foi exposto durante 10 minutos a diferentes crioprotetores (DMSO, etilenoglicol e metanol), tendo sido realizadas análises de mobilidade. Nos ensaios de criopreservação, o sémen foi exposto às mesmas condições anteriormente descritas para os testes de toxicidade (mesmos crioprotetores e mesmo tempo de equilíbrio) tendo sido posteriormente exposto a duas rampas de congelação. Depois de descongelado, realizaram-se análises de mobilidade e a viabilidade. Com a realização destes procedimentos concluiu-se que a suplementação de DMSO com açucares não melhora a mobilidade, viabilidade ou diminui a fragmentação de DNA no sémen de Crassostrea angulata. Nos ensaios de fertilização, quando foi usado sémen criopreservado o melhor rácio de espermatozóide por ovo foi 50000:1, a trealose não melhora a taxa de fertilização e não foi observado qualquer efeito na variação do volume de água na fertilização. Para a Chamelea gallina, os testes de toxicidade demonstraram que o DMSO foi o crioprotector mais adequado. No entanto, o sémen descongelado não apresentou qualquer mobilidade. Em termos de viabilidade, o DMSO mostrou resultados mais elevados, e as melhores condições para a criopreservação do sémen desta espécie foram atingidas com a rampa de congelação mais rápida. No entanto, serão necessários mais estudos para o desenvolvimento de um protocolo de criopreservação com sucesso para a C. gallina
