A presente dissertação insere-se no âmbito do estudo do desenvolvimento embrionário,
uma área de crescente interesse que integra biologia molecular e celular, genética, fisiologia,
neurobiologia e imunologia. O modelo animal escolhido para estes estudos foi o ratinho (mus
musculus). Entre Humano e ratinho existe uma conservação evolucionária que se reflecte ao
nível do genoma, partilhando entre eles 99% da sequência de ADN e uma organização idêntica
dos cromossomas, assim como a natureza dos genes codificados. Recentemente, grandes
avanços tecnológicos tornaram possível a manipulação do genoma de ratinho em células
estaminais embrionárias, e a construção de linhas mutantes de genes de interesse com
fenótipos relevantes servem de base ao estudo da biologia dos mamíferos e à compreensão
dos mecanismos de doenças. Este conhecimento pretende-se que seja aplicado no
desenvolvimento de novas técnicas de diagnóstico de terapia.
Nesta era pós-genómica, em que foi tornado publico sequências genómicas, tem sido
possível interpretar os mais diversos acontecimentos celulares em termos de regulação
genética. No que diz respeito ao conhecimento sobre o desenvolvimento embrionário de
ratinho, vários estudo genéticos levaram à identificação de vias de sinalização essenciais para o
controlo de crescimento celular e diferenciação do embrião, desde a formação do blastocisto,
durante a gastrulação e organogénese. Em particular, o estudo da formação dos eixos
embrionários tem sido um dos grandes desafios na área da biologia do desenvolvimento. O
corpo de um vertebrado constrói-se em torno dos eixos Anterior-Posterior (A-P), Dorso-Ventral
(D-V) e Esquerdo-Direito (E-D), um processo que depende da regulação de transcrição genética
e sinalização intercelular, quer ao nível temporal como espacial. Várias experiências realizadas
em vertebrados inferiores levaram à identificação de vários factores de transcrição e estruturas essenciais no desenvolvimento embrionário. Contudo, existe uma relevância relativa da função
destes genes e estruturas quando comparados em termos evolutivos. Ainda assim, é possível
identificar alguns mecanismos fundamentais de regulação genética da diferenciação celular e
definição dos eixos embrionários, conservados entre espécies. São exemplo, as vias de
sinalização de WNT, TGF-β (Transforming Growth Factor β) e FGF (Fibroblast Growth Factor).
No embrião de ratinho identificou-se a Endoderme Visceral como uma estrutura
fundamental para a organização do epiblasto. Trata-se de um tecido extra-embrionário que
regula a actividade de factores de crescimento da família dos TGFβ, tais como os BMPs (Bone
Morphognetic Protein) e Nodal, assim com as vias de sinalização dos WNT, gerando um
gradiente de expressão genética ao longo do embrião. Actualmente, considera-se que este
padrão de assimetria genética é a base para a definição dos eixos embrionários. Em particular,
no que diz respeito à formação do eixo A-P, a Endoderme Visceral Anterior (EVA) tem sido
indicada como um centro organizador das estruturas anteriores no embrião de ratinho. A EVA é
uma população de células da endoderme visceral que apresenta uma morfologia distinta,
localizada na região distal do embrião com 5.5 dias de desenvolvimento, e que tem a
capacidade se movimentar, migrando e demarcando a futura região anterior do embrião
aquando do início da gastrulação. Na EVA são expressos vários genes tais como cerl-1, lefty1,
Hex, goosecoid, otx2, Hesx1, lim1, dkk1, produzindo antagonistas das vias de sinalização de WNT,
Nodal e BMP.
O primeiro estudo realizado com Cerberus, em Xenopus, demonstrou que esta proteína tem
a capacidade de inibir a actividade dos ligandos Nodal, BMP4 e Wnt, permitindo, assim, a
formação de cabeça e estruturas anteriores. O homólogo de Cerberus em ratinho, cerberuslike1,
é expresso na EVA, mas a sua função ainda não foi determinada. Ratinhos mutantes
homozigóticos do gene cerl1 não apresentam qualquer fenótipo: são viáveis e animais férteis sem qualquer alteração no que diz respeito a organização de estruturas anteriores ou qualquer
outro órgão/estrutura ao longo de todo o organismo. No entanto, estudos posteriores
demonstram que Cerl1 actua em cooperação com Lefty, proteínas também conhecidos pelo
seu carácter antagonista em relação a Nodal. A expressão de Cer1 e Lefty1 na EVA inibe a via de
sinalização de Nodal no epiblasto, limitando a acção de Nodal à zona posterior do embrião.
Com o intuito de aprofundar o conhecimento da via de sinalização Nodal, e uma vez que
esta é extremamente importante durante o desenvolvimento embrionário, efectuou-se um
estudo desenhado para avaliar potenciais interacções entre Cerl1 e Cripto. Cripto é expresso no
epiblasto, durante o desenvolvimento embrionário de ratinho, está envolvido na definição do
eixo A-P e na formação da mesoderme, e tem sido indicado com um co-receptor necessário
para a transdução de sinais Nodal. A experiência consistiu na remoção em simultâneo do
antagonista Cer1 e do co-receptor Cripto, através de cruzamentos de linhas mutantes de
ratinhos. A análise dos embriões duplo mutante Cer1;Cripto mostrou que é possível recuperar
parcialmente do fenótipo observado no embriões Cripto-/-, nomeadamente a orientação do
eixo A-P, a formação de mesoderme e neuroectoderm. Estes resultados indicam que a
determinação do eixo A-P é regulada pela via de sinalização Nodal, no entanto trata-se de um
mecanismo independente do co-receptor Cripto.
Uma vez que ao longo destes anos a Endoderme Visceral Anterior tem sido apontada como
uma das estruturas embrionárias envolvidas na organização dos eixos, foi realizado um rastreio
diferencial a afim de identificar os genes que são expressos, preferencial e/ou exclusivamente,
nesta região. Recorrendo a uma linha de ratinhos transgénica na qual a proteína EGFP é
expressa sobre a acção do promotor de Cerl-1, foi possível acompanhar visualmente a migração
das células da endoderme visceral, desde a extremidade distal até à posição da futura região anterior do embrião. Uma vez determinadas as regiões anterior-distal (Ad) e posterior-proximal
(Pp), sendo esta diametralmente oposta à primeira, dos embriões transgénicos no estádio de
desenvolvimento E5.5, procedeu-se à micro-dissecação da endoderme visceral e
consequentemente da porção de epiblasto associada a esta. Ambas as amostras, Ad e Pp,
foram analisadas através da hibridação de mRNA em Affymetrix GeneChip ®. Como resultado,
obtemos uma lista de genes que apresentam uma expressão diferencial na endoderme visceral
anterior. Dentro deste grupo foi possível encontrar uma sobre expressão de lefty1, cer1, gsc,
hesx1, lhx (lim1), foxa2 (hnf3β) e otx2, genes que têm sido estudados e já foram identificados
com pertencentes exclusivamente à região anterior-distal e que, por sua vez, valida qualquer
novo resultado obtido com esta experiência.
Atendendo ao principal objectivo de caracterizar e compreender melhor o papel da
endoderme visceral anterior durante o desenvolvimento embrionário de ratinho, prosseguiu-se
com o estudo de 3 novos genes identificados no rastreio realizado: Adtk1, e os genes GalNAc4S-
6ST e MAd4 dos quais fui a principal responsável pela condução dos trabalhos de investigação
aqui reportados.
N-Acetilgalactosamina 4-sulfato 6-O-Sulfotransferase (GalNAc4S-6ST) é um enzima que
participa na síntese da unidade GlcAβ1-3-GalNAc(4,6-bisSO4) do sulfato de condroitina E (CS-E).
O CS-E é um proteoglicano, um tipo de proteínas abundantes na matriz extracelular,
conhecidos pela capacidade de se ligar a uma variedade de factores de crescimento incluindo
membros da família de TGFβ, Wnt, e FGF, necessários na diferenciação celular e morfogénese
do embrião de ratinho. O padrão de expressão GalNAc4S-6ST gene durante o desenvolvimento
embrionário mostra que este gene é inicialmente expresso na endoderme visceral anterior,
passando gradualmente a marcar a endoderme definitiva, na porção mais anterior do embrião. Ao longo do desenvolvimento, GalNAc4S-6ST é expresso na mesoderme e endoderme do
futuro tubo intestinal, no ante-cérebro, e nos arcos branqueais. Recentes dados, revelaram que
no estádio de desenvolvimento E 14.5, este gene encontra-se activo em várias regiões do
cérebro, sistema nervoso central e periférico, assim como no sistema urogenital. É ainda de
salientar que GalNAc4S-6ST foi identificado como um genes activados pela via de sinalização
Nodal/Activin, o que pode indicar uma possível função na transmissão do sinal de Nodal
durante o desenvolvimento embrionário. No entanto, a análise do mutante homozogótico de
GalNAc4S-6ST, mostrou no entanto que este gene não é fundamental para desenvolvimento
embrionário. Os animais são viáveis e não apresentam fenótipos muito severos, apenas uma
alteração na composição morfológica dos ossos, quando comparado com o WT.
O presente trabalho serve também para apresentar um novo gene, provisoriamente
designado de MAd4 – Mouse Anterior-distal #4. Trata-se de um gene que codifica uma proteína
de 99 aminoácidos com domínio transmembranar, pertencente a uma família conservada entre
C. elegans, Drosophila melanogaster, zebrafish, Xenopus leavis, ratinho e humano. No entanto a
sua função biológica, molecular e celular é desconhecida. A análise do padrão de expressão de
MAd4 mostra que este gene é regulado a nível espacial e temporal, sendo expresso em
diferentes estruturas e em diferentes etapas do desenvolvimento embrionário. O gene MAd4
começa por ser expresso na EVA e na endoderme definitiva localizada na região mais anterior
do embrião. Encontra-se expresso na endoderme do futuro tubo digestivo, na neuroectoderm,
na notocorda e no nó. Durante a organogénese, MAd4 está activo no fígado, na espinalmedula,
na retina, no telencefalo e metaencefalo. Em diferentes etapas do desenvolvimento
embrionário a expressão de MAd4 sobrepõe-se à expressão de, por exemplo, Dkk1 e Sox17 na
endoderme visceral, Hnf3-β e Gata4 na endoderme do tubo intestinal, e Nog e Chrd na notocorda. A função de MAd4 continua ainda por determinar, no entanto Células Estaminais
Embrionárias foram manipuladas afim de produzir um ratinho mutante, e com este modelo
animal proceder ao estudo da perda de função.
Os dois novos genes apresentados neste trabalho – GalNAc4S-6ST e Mad4 – fazem parte dum
complexo conjunto de moléculas encontradas na Endoderme Visceral Anterior, uma estrutura
necessária ao desenvolvimento embrionária de ratinho. A função específica destes novos
genes na EVA continua por se determinar, no entanto os resultados obtidos mostram que são
genes com uma expressão genética regulada ao nível espacial e temporal, participando
activamente na formação de várias estruturas do embrião. Contudo, esta nova informação vem
contribuir para a análise do genoma de ratinho e melhor compreensão dos mecanismos
biológicos do desenvolvimento embrionário
