Dissertação de mestrado, Biotecnologia, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2017Fish aquaculture is a viable and profitable industry worldwide and monitoring fish larvae health and growth is a key step. The gilthead sea bream (Sparus aurata) is an economically important species reared mainly under mesocosm and intensive aquaculture systems. However, heterogeneous larvae growth and anatomic deformations are observed using these systems and few molecular markers to monitor fish growth are currently in use.
Desmosomes are a type of cell-cell junction formed by a protein complex that promotes strong connections between cells, playing a crucial role in the maintenance of tissue integrity. Desmosomal genes are well studied in human but poorly in fish, thus their potential as an additional molecular marker to monitor fish growth and health in aquaculture remains to be explored.
The aim of this project was to study the desmosomal genes evolution in fish and characterize their potential involvement in fish development and physiology in aquaculture. The results showed that desmosomal genes largely expanded in fish when compared to other vertebrates and teleosts possess a single desmocollin (dsc); three desmogleins (dsg a,b and c); two plakoglobins (pg a and b); two desmoplakins (dp a and b) and seven plakophilins (pkp 1a, 1b, 2, 3a, 3b, 4a and 4b). Dsc and dsg b were the candidates and their expression in Sparus aurata was analyzed in various experiments. In general their expression in larvae was not affected by the aquaculture systems. However, these genes seem to be associated with growth, in larvae exhibiting heterogeneous growth, the smaller individuals have the dsg b expression significantly up-regulated (p < 0.05) compared to the dsc. Thus these genes have potential to be used as molecular markers of growth. Different dsc profile expressions were found among the experiments, revealing that genetic background may also influence the expression of this gene.A aquacultura tem crescido vastamente ao longo das últimas décadas e emergido como uma alternativa às práticas pesqueiras. Os peixes são o principal organismo produzido e atualmente a sua produção mundial é aproximadamente 160 milhões de toneladas por ano. Consoante a densidade larvar a aquacultura pode ser classificada em diferentes categorias: extensiva, mesocosmo e intensiva. A dourada (Sparus aurata) é uma espécie bastante importante a nível económico no Mediterrâneo cuja produção em aquacultura tem registado um crescimento exponencial desde o início dos anos 90 até à atualidade. A sua produção é essencialmente sob regime intensivo e mesocosmo. Porém, estudos revelaram que esta espécie produzida em sistemas intensivos exibe deformações morfológicas e taxas de sobrevivência larvares menores quando comparadas com o sistema mesocosmo. Assim a seleção do sistema de aquacultura mais apropriado representa um desafio devido ao impacto que estes sistemas têm na saúde e crescimento dos indivíduos. Outro dos maiores desafios associado aquacultura é o crescimento não homogéneo das larvas de peixe. A origem deste problema permanece desconhecido e provoca perdas económicas elevadas devido às agressões e comportamentos canibalescos dos indivíduos maiores sobre os menores.
As formas clássicas de avaliar o crescimento larvar baseiam-se na caracterização do músculo, executando-se colorações por forma a contar as fibras e as dimensões das mesmas. Novas formas de avaliação têm vindo a emergir, recentemente o gene mlc2 foi descrito como um marcador molecular de performance de crescimento de larvas de dourada em aquacultura.
Os desmossomas são um tipo de junção celular constituídos por um vasto complexo de proteínas que promove ligações fortes entre as células. Em humanos estão envolvidos em vários processos, tais como: proliferação, diferenciação e morfogénese. A disrupção destas estruturas tem efeitos drásticos na integridade celular, desta forma o seu mau emparelhamento tem vindo a ser associado a uma serie de doenças. Estruturalmente estas junções celulares são constituídas por proteínas de três famílias: caderinas (desmocolinas e desmogleínas), armadilho (plocoglobinas e placofilinas), e plaquinas (desmoplaquinas). A arquitetura dos desmossomas baseia-se na ligação heterofílica das proteínas transmembranares (desmocolinas e desmogleínas) na zona extracelular das células, as suas caudas intracelulares por sua vez ligam-se às proteínas armadilo que interagem com as desmoplaquinas que finalizam a conexão da estrutura com a rede de filamentos intermédios das células. O papel destas proteínas é vastamente estudado em mamíferos, porém em peixes um único estudo foi realizado. Os resultados do silenciamento das caderinas desmossomais provocou fenótipos severos no peixe zebra e redução da integridade celular, revelando assim também um papel de extrema importância nos peixes.
Este projeto focou-se na biotecnologia azul e em termos gerais pretendeu-se enriquecer o conhecimento sobre este grupo de genes, desvendar como evoluíram nos peixes teleósteos e correlacionar com o seu desenvolvimento e crescimento, utilizando como modelo a dourada devido ao seu elevado interesse comercial. A nível de metodologia o projeto foi dividido em duas partes:
a) Análises bioinformáticas – identificação in silico de genes desmossomais em peixes e outros vertebrados para execução de análises filogenéticas;
b) Técnicas de biologia molecular – avaliação da expressão de caderinas desmossomais durante o desenvolvimento larvar, em larvas cultivadas em diferentes sistemas de aquacultura (intensivo e mesocosmo) e em larvas que exibissem crescimentos heterogéneos, por forma a correlacionar estes genes com os principais problemas da aquacultura acima referidos, utilizando q-RT-PCR.
Foram encontrados homólogos dos genes desmossomais humanos em várias espécies. No geral foram identificados em teleósteos: uma desmocolina (dsc); três desmogleínas (dsg a,b e c); duas placoglobinas (pg a e b); duas desmoplaquinas (dp a e b); sete placofilinas (pkp 1a, 1b, 2, 3a, 3b, 4a e 4b). Os genes desmossomais apresentam trajetórias evolutivas distintas de espécie para espécie, tendo sido identificadas duplicações específicas de espécies que sugerem ter um papel funcional especifico em cada espécie, potencialmente associado à sua adaptação ao meio. Devido ao seu papel crucial na formação da estrutura desmossomal e da sua evolução complexa, as caderinas desmossomais foram selecionadas pra se efetuar os estudos de expressão. A dsc, dsg b e dsg c foram isoladas na dourada, permanecendo o duplicado a por ser isolado e sendo o c uma nova descoberta alcançada neste projeto. A expressão tecidular em conjunto com uma pesquisa em bases de dados de EST revelou que a dsc é amplamente expressa enquanto as dsg apresentam uma distribuição mais restrita. Em humano, diferentes combinações destas proteínas foram descritas consoante o tipo de célula e camada celular, o mesmo parece se verificar nos teleósteos. A dsc e dsg b foram identificadas em larvas enquanto a dsg c parece estar ausente nesta fase, o que indica também uma combinação das caderinas desmossomais associada à fase desenvolvimento dos peixes. Análises de expressão de dsc e dsg b em larvas que apresentava crescimento heterogéneo, revelou que os indivíduos menores expressam níveis maiores de dsg b e esta é significativamente sobre expressa em comparação à dsc (p < 0.05). Correlações entre estes genes e genes associados ao desenvolvimento do músculo foram observadas (myog, igf-2 e fst). Após eclodirem, as larvas apresentam um período intenso de hiperplasia (recrutamento de fibras de músculo) que ocorre entre os 15-25 dias após eclosão e posteriormente um período de hipertrofia (aumento do tamanho das fibras existentes). Curiosamente, no geral foi no período de hiperplasia que níveis mais elevados de dsc e dsg b foram observados. Isto indica que a expressão destes genes está possivelmente mais associado ao recrutamento de fibras musculares do que ao aumento das mesmas, justificando assim o facto dos indivíduos menores apresentarem uma no geral níveis maiores de dsg b e uma sobre expressão desta em relação à dsc. Estes resultados sugerem que estes genes poderão servir como marcadores moleculares de crescimento em larvas de peixe em aquacultura. No geral os sistemas de aquacultura não parecem influenciar a diferença de expressão de dsc e dsg b, o que sugere que o tipo de sistema de aquacultura não tem impacto na integridade celular neste período (5-60 dias após ecolosão). Os resultados mais surpreendentes foram as diferenças de expressão de dsc obtidas nas diferentes experiencias, sugerindo que fatores genéticos podem influenciar fortemente a expressão destes genes visto que que as amostras eram provenientes de stocks diferentes
