Dissertação de mestrado, Aquacultura e Pescas, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2017Seaweed are a diverse group of algae with great value and vast application possibilities.
The seaweed Fucus vesiculosus, stands out for having elevated concentrations of polyphenols and
antioxidant activities. Polyphenols possess many biological properties including antioxidant,
antimicrobial, anti-inflammatory, and free radical scavenging activities. Therefore, this species is
a possible candidate as natural source of bioactive compounds for the development of novel
products to be applied in the nutraceutical, pharmaceutical, and cosmetic industries, in the future.
This project aimed to investigate the effects of seasonality, and culture conditions such as salinity
and ultraviolet radiation (UV) on the antioxidant contents and in vitro properties of F.
vesiculosus. This was carried out through spectrophotometric analysis, namely total phenolic
contents (TPC), high performance liquid chromatography (HPLC), α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl
(DPPH) radical scavenging activity and iron chelating capacity. Furthermore, the epiphytic algae
coverage was determined and physodes (structures containing phenolics) were investigated
microscopically through vanillin-HCL staining.
This information was used to identify the best harvest time targeting the highest
concentration of antioxidants, which was hypothesized to be in late summer-early autumn, due to
the protection against UV-irradiation over summer by phenolic accumulation. Significant
differences supporting seasonality in antioxidants were found. Late Spring to early Fall had the
highest extraction yields (P»0.0045) and concentrations (P< 0.0010) in contrast to the lowest
winter concentrations. A total of 13 monophenolic acids were detected through RP-HPLC, with
September samples being the most diverse in compounds and March samples the least. Gallic
acid was identified in all analyzed months. Furthermore, antioxidant contents and activity was
linked to environmental parameters, namely positive correlations between temperature, TPC (P=
0.0391) and DPPH (P= 0.0016); likewise, between sunlight hours per day, TPC (P= 0.0458) and
DPPH (P=0.0060). During experimental growth trials, three salinity concentrations and presence
of UV light were tested, to verify or reject the second hypothesis: increasing salinity and
exposure to UV light would yield higher polyphenolic concentrations. No significant differences
were observed between the TPC and salinity (P=0.0525), and light (P=0.2443), under the
experimental conditions tested. Regarding growth rate there were significant differences between
different salinities (P=0.0216). Lastly, physodes were observed to test a third hypothesis
inquiring on their location within tissues. Microscopic images revealed that physodes were
distributed mainly in the outer layers of the blades, epidermis and outer cortical layers, serving as
a shield effect.As algas são um grupo diversificado de organismos muito valorizado com várias
aplicações, que atualmente constituem um recurso marinho sub-explorado. O grupo das algas
castanhas é conhecido pelo seu elevado valor nutricional incluindo vários compostos
bioativos, na sua composição. Dentro deste grupo, a espécie Fucus vesiculosus, ou Bodelha,
destaca-se por ter uma atividade antioxidante forte, associada a elevados níveis de polifenóis.
Os polifenóis pertencem a uma classe de moléculas que possuem muitas propriedades
biológicas, incluindo atividade antioxidante, antimicrobiana, anti-inflamatória e de
eliminação de radicais livres. Assim, esta espécie representa uma escolha plausível para o
desenvolvimento de novos produtos a serem aplicados na indústria nutracêutica, farmacêutica
e cosmética, futuramente. Esta tese de mestrado teve como objetivo analisar a variação de
conteúdos antioxidantes, através da identificação, quantificação e caracterização das
propriedades in vitro de polifenóis, na macroalga F. vesiculosus. Nomeadamente através de
uma análise espectrofotométrica, HPLC e TPC, do método do radical DPPH e da medição da
atividade quelante de ferro. O projeto dividiu-se em duas etapas principais: sendo o primeiro
o mapeamento das variações sazonais no conteúdo de polifenóis e atividade antioxidante em
amostras de populações naturais. E a segunda, a identificação das condições de cultura
ótimas, nomeadamente, salinidade e exposição a radiação UV, numa experiência à escala de
laboratório, de forma a otimizar a concentração de polifenóis. Adicionalmente, as algas
epífitas e os físodos foram observados ao microscópio ótico. Os físodos são vesículas que
contém os polifenóis na célula vegetal e a técnica de coloração com vanilina-HCL permite a
sua observação.
A alga F. vesiculosus foi amostrada mensalmente da praia Bellevue, a norte de
Copenhaga, na Dinamarca, contemplando as diferentes estações de um ano completo.
Pigmentos e polifenóis foram extraídos de algas previamente liofilizadas. Estes compostos
foram identificados (sempre que possível), quantificados e caracterizados através de ensaios
antioxidantes. Esta informação foi utilizada para identificar o melhor período de colheita
desta espécie de alga, visando uma maior concentração em compostos antioxidantes. Este
período foi considerado como hipótese sendo no final de verão - início de outono, devido à
acumulação destes compostos durante o verão, que servem como proteção contra as radiações
ultravioletas. Foram obtidas diferenças significativas que evidenciam a sazonalidade em
antioxidantes nesta espécie. Os produtos de extração (P»0.0045) e concentração de polifenóis
(P< 0.0010) mais elevados foram obtidos desde o final da primavera até ao início de outono, em contraste com os meses de inverno, com os valores mais baixos. O número e tipo de
pigmento manteve-se constante ao longo de todas as estações, estando sempre oito picos em
cada cromatograma. Os pigmentos foram identificados como duas clorófilas, (clorofila C2 e
clorofila-a) e seis carótenoides (fucoxantina, Prasinaxantina, dinoxantina, Diatoxanthin,
Zeaxantina a carotenos a+b). Os pigmentos demonstraram sazonalidade quantitativamente,
sendo que a sua concentração aumenta do verão para o inverno e primavera, de forma a
compensar a diminuição de luz disponível. Foram detectados 13 ácidos monofenólicos,
através da análise de UV RP-HPLC, setembro foi o mês com maior diversidade de compostos
e março o de menor diversidade. Ácido gálico foi identificado e estava presente em todos os
meses analisados. Os conteúdos antioxidantes e a atividade antioxidante demonstraram
correlação positiva com parâmetros ambientais, nomeadamente correlações positivas entre a
temperatura, TPC (P= 0,0391) e DPPH (P= 0,0016); bem como entre as horas de luz solar,
TPC (P= 0,0458) e DPPH (P= 0,0060).
Durante o ensaio experimental, foram testadas três concentrações de salinidade (»13,
28 e 40 PSU) e ainda a exposição a radiação UV, para verificar ou rejeitar a segunda hipótese
deste projeto, de que com o aumento das variáveis em questão, seria possível otimizar a
concentrações de polifenóis. Não foram observadas diferenças significativas entre os
tratamentos para a TPC relativamente à salinidade (P=0.0525) e à luz (P=0.2443), nas
condições experimentais testadas. Houve diferenças significativas entre a taxa de crescimento
dos tratamentos para diferentes salinidades (P=0.0216). No decorrer da experiência,
problemas em manter os níveis de salinidade constante poderão ter influenciado os resultados
obtidos. Por último, físodos foram observados microscopicamente para testar a terceira
hipótese, que inquiria sobre a sua localização nos tecidos. Imagens microscópicas revelaram
um efeito de escudo, uma vez que os físodos se encontram distribuídos principalmente nas
camadas externas das algas: na epiderme e camadas corticais externas. Os meses de verão
coincidiram com a altura de maior incidência de algas epífitas, das quais três espécies foram
encontradas a crescer sobre F. vesiculosus (verde, castanha e vermelha). A herbivoría e o
parasitismo de organismos epífitos sobre esta alga é também um dos motivos descritos
noutros estudos para justificar o aumento das concentrações de polifenóis durante os meses
de verão
