Dissertação de mest., Qualidade em Análises, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Univ. do Algarve, 2012Existem apenas alguns métodos disponíveis para o estudo da ligação de metais ao ADN. Estes são baseados em técnicas espectroscópicas, que podem apenas ser utilizadas quando determinados cromóforos quer da molécula de ADN ou dos complexos metálicos estão directamente envolvidos na ligação de metais ao ADN.
O objectivo deste projecto foi desenvolver um novo método que pode ser utilizado para detectar a ligação de um metal de transição ao ADN, utilizando Electroforese em gel de agarose (EGA). O método tem sido estudado para complexos de vanádio, mas pode ser adaptado para quaisquer metais de transição susceptíveis de sofrer reacções de tipo Fenton. O novo método envolve a adição ao gel de agarose de ácido tereftálico (TPA), um indicador bem conhecido para os radicais hidroxilo. Embebendo o gel desenvolvido em peróxido de hidrogénio, a presença de vanádio será revelada por uma reacção do tipo Fenton que irá gerar radicais hidroxilo e irá hidroxilar TPA em 2-hidroxi-TPA, uma molécula altamente fluorescente. Bandas electroforéticas contendo vanádio podem então ser fotografadas e analisadas utilizando um sistema de imagem.
A metodologia envolveu quatro passos:
1. Um estudo preliminar do sistema utilizando a EGA.
2. O desenvolvimento do método para a quantificação dos complexos de vanádio baseado no mesmo sistema de reacção utilizando amostras aquosas.
3. Desenvolvimento do método em soluções aquosas com uma matriz semelhante à de agarose.
4. Aplicação em géis de agarose.
Os resultados preliminares foram mal sucedidos para detectar a presença de vanádio em géis de agarose. Concluiu-se que para ser usado um sistema de imagem, o método requer a utilização de um filtro (464 ± 40) nm. Foram efectuados mais testes utilizando um espectrofluorímetro.
Quando se utilizou um concentrado peroxide (~ 9M), a intensidade máxima de fluorescência de 2-OH-TPA formado diminuiu ao longo do tempo. Com um peróxido menos concentrado (1,8 mM) foi obtida uma boa sensibilidade. O LOD (limite de detecção) determinado para o vanádio foi de 4,1 μM.
O sistema foi depois testado num sistema aquoso com galactose. O sistema tem uma boa gama de trabalho, até 300 μM na presença de 0,50% de galactose. A sensibilidade diminuiu significativamente na presença de galactose. O LOD determinado para o vanádio foi de 5,4 μM.
O sistema foi finalmente testado em géis de agarose. Houve alguma dificuldade em assegurar a homogeneidade da preparação, necessária para um estudo espectrofluorimétrico. Num gel onde a homogeneidade foi conseguida, foi observada uma banda de emissão muito fraca na região do espectro onde o complexo 2-hidroxi-TPA emite. A sensibilidade obtida nesta preparação foi muito baixa.
Não foi possível completar os testes em EGA devido à falta de tempo disponível para este trabalho. No entanto, os resultados em solução aquosa mostram que o método é viável e pode proporcionar uma boa sensibilidade quando aplicado em matrizes EGA, desde que o método para a preparação de gel seja optimizado
