Phytophthora cinnamomi e P. cambivora são considerados os agentes
patogénicos da doença da tinta do castanheiro. Estes agentes invadem e
destroem o sistema radicular, levando à morte das árvores e a importantes
perdas económicas.
O declínio do montado tem sido associado a vários agentes patogénicos,
pragas e factores abióticos. Phytophthora cinnamomi tem sido
referido como um potencial agente patogénico do sobreiro e azinheira.
O aparecimento de mais estirpes de microrganismos patogénicos resistentes
a pesticidas impõe o desenvolvimento de novas estratégias de
biocontrolo, entre as quais a estimulação de reações de defesa.
As elicitinas são proteínas de baixo peso molecular, secretadas por
algumas espécies de oomycetes (Phytophthora e Pythium) que induzem
reações de hipersensibilidade e aquisição de resistência sistémica nas
plantas, contra um grande número de bactérias e fungos patogénicos.
Este trabalho é uma síntese dos resultados sobre o efeito da aplicação
radicular de várias elicitinas, na infeção do sobreiro, azinheira e castanheiro
por P. cinnamomi. A avaliação foi efetuada por observação microscópica
dos tecidos invadidos, em especial dos tecidos vasculares.
Observou‑se
a indução de reações de defesa contra P. cinnamomi
quando se submeteram as raízes destas três espécies a pré‑tratamento com as elicitinas criptogeína, capsiceína ou cinamomina. A infeção ficou
restrita aos tecidos corticais da raiz, onde o agente patogénico se desorganizou
e não progrediu para os vasos, estando associado à acumulação
de materiais que se presume serem tóxicos, produzidos nas células dos
hospedeiros, em contato com as hifas em desorganização.
Os ensaios laboratoriais indicaram que as elicitinas testadas se revelaram
muito eficientes no biocontrolo de P. cinnamomi. Será de grande
importância desenvolver tecnologia no sentido de obtenção de elicitinas
a baixo custo e de criar sistemas eficientes da sua dispersão nas plantas

Candeias, I.

Cravador, A.

Maia, I.

Medeira, C.

Melo, Eduardo P.

Moreira, A. C.

Sousa, Nelson

Sapientia

709A utilização de elicitinas no combate contra Phytophthora cinnamomi na doença da tinta do castanheiro e no declínio do montadoIsabel Maia 1, Clara Medeira1, Ana Cristina Moreira 2, Irene Candeias2, Elvira Melo2, Nelson de Sousa 3 e Alfredo Cravador3ResumoPhytophthora cinnamomi e P. cambivora são considerados os agentes patogénicos da doença da tinta do castanheiro. Estes agentes invadem e destroem o sistema radicular, levando à morte das árvores e a importan‑tes perdas económicas.O declínio do montado tem sido associado a vários agentes pato‑génicos, pragas e factores abióticos. Phytophthora cinnamomi tem sido referido como um potencial agente patogénico do sobreiro e azinheira. O aparecimento de mais estirpes de microrganismos patogénicos re‑sistentes a pesticidas impõe o desenvolvimento de novas estratégias de biocontrolo, entre as quais a estimulação de reações de defesa.As elicitinas são proteínas de baixo peso molecular, secretadas por algumas espécies de oomycetes (Phytophthora e Pythium) que induzem reações de hipersensibilidade e aquisição de resistência sistémica nas plantas, contra um grande número de bactérias e fungos patogénicos. Este trabalho é uma síntese dos resultados sobre o efeito da aplicação radicular de várias elicitinas, na infeção do sobreiro, azinheira e casta‑nheiro por P. cinnamomi. A avaliação foi efetuada por observação mi‑croscópica dos tecidos invadidos, em especial dos tecidos vasculares.Observou ‑se a indução de reações de defesa contra P. cinnamomi quando se submeteram as raízes destas três espécies a pré ‑tratamento 1  INRB, I.P. / L‑INIA, Unidade de Investigação de Recursos Genéticos, Ecofisiologia e Melhoramento de Plantas, Quinta do Marquês, 2784‑505 Oeiras, Portugal;   e‑mail: clara.medeira@inrb.pt; isabel.maia@inrb.pt2  INRB, I.P. / L‑INIA, Unidade de Investigação de Proteção de Plantas, Quinta do Marquês, 2784‑505 Oeiras, Portugal; e‑mail: acmarcellino@yahoo.com.br3  IBB/CGB, Universidade do Algarve, Campus de Gambelas, 8005‑139 Faro, Portugal;   e‑mail: acravad@ualg.ptINIA.indd   709 25/10/11   11:05:44710Agrorrural: Contributos Científicoscom as elicitinas criptogeína, capsiceína ou cinamomina. A infeção ficou restrita aos tecidos corticais da raiz, onde o agente patogénico se desor‑ganizou e não progrediu para os vasos, estando associado à acumulação de materiais que se presume serem tóxicos, produzidos nas células dos hospedeiros, em contato com as hifas em desorganização.Os ensaios laboratoriais indicaram que as elicitinas testadas se reve‑laram muito eficientes no biocontrolo de P. cinnamomi. Será de grande importância desenvolver tecnologia no sentido de obtenção de elicitinas a baixo custo e de criar sistemas eficientes da sua dispersão nas plantas.Palavras ‑chave: citologia, colonização vascular da raiz, reações de defesa.1. IntroduçãoOs montados de sobro e azinho são ecossistemas de grande impor‑tância económica e ecológica na região mediterrânica ocidental, especial‑mente na Península Ibérica. Protegem o solo da radiação solar e da erosão, constituindo uma primeira barreira à desertificação nas regiões semiáridas do Sul, caracterizadas por solos pobres expostos a condições climáticas adversas (Horta et al., 2010). Apesar da tolerância a condições climáti‑cas extremas, estas espécies sofrem períodos consecutivos de seca (Grant et al., 2010), tornando ‑as mais vulneráveis a stresses bióticos e abióticos.O declínio do montado que afeta severamente o sobreiro e azinheira em Portugal e em Espanha tem sido associado à Phytophthora cinna‑momi (Brasier, 1992; Sánchez et al., 2002; Moreira e Martins, 2005), entre outros agentes patogénicos, pragas e fatores abióticos. Algumas espécies do montado (Cistus spp., Ulex spp e Arbutus unedo) têm tam‑bém sido referidas como hospedeiros.Para além do montado, Phytophthora cinnamomi e P. cambivora são considerados os agentes patogénicos da doença da tinta do castanheiro. Estes agentes invadem e destroem o sistema radicular, levando à morte das árvores.Phytophthora cinnamomi pode permanecer no solo por muito tempo, esporulando quando as condições são favoráveis e produzindo zoóspo‑ros que se deslocam e que são atraídos pelas raízes infetando as plantas suscetíveis. Este agente patogénico que é um oomycete infeta mais de 3 000 espécies selvagens e cultivadas (Hardham, 2005).INIA.indd   710 25/10/11   11:05:44711Ecofisica, recursos genéticos e melhoramento de plantasO aparecimento de um número cada vez maior de estirpes de mi‑crorganismos patogénicos resistentes a pesticidas impõe o desenvolvi‑mento de novas estratégias de biocontrolo na proteção das plantas. No contexto de uma agricultura sustentável, é importante a estimulação de reações de defesa contra a invasão de agentes patogénicos. Dos trabalhos desenvolvidos nesta área destacam ‑se os tratamentos com elicitinas que são proteínas de baixo peso molecular, secretadas por algumas espécies de oomycetes ‑Phytophthora (Ricci et al., 1989) e Pythium (Panabières et al., 1997) e que induzem nas plantas reações de hipersensibilidade e aquisição de resistência sistémica contra um grande número de bacté‑rias e fungos patogénicos (Ricci et al., 1989; Ricci, 1997; Piccard et al., 2000).Criptogeína é uma elicitina secretada por Phytophthora cryptogea que quando aplicada nas plantas do tabaco induziu reações de defesa contra P. parasitica (Milat et al., 1991; Lheirminier et al., 2003). Oligandrina é também uma proteína com características das elicitinas, secretada por Pythium oligandrum, que levou à expressão de reações de resistência no tomateiro quando pré ‑tratado com esta proteína e inoculado com P. pa‑rasitica (Piccard et al., 2000). A oligandrina quando aplicada às raízes da videira limitou a progressão de Botrytis cinerea nas folhas por indução de reações de defesa no hospedeiro e degradação do agente patogénico (Mohamed et al., 2007).Foi objetivo deste trabalho verificar a resposta do sobreiro, azinheira e castanheiro à infeção por P. cinnamomi após pré ‑tratamento das raí‑zes com as elicitinas criptogeína, capsiceína (secretada por P. capsici), e cinamomina (secretada por P. cinnamomi). A avaliação foi efetuada pela observação microscópica dos tecidos radiculares invadidos, em especial do tecido vascular.2. Material e MétodosA – As raízes de plantas com quatro meses, obtidas da germinação de sementes, foram imersas em solução aquosa de elicitinas (500 a 100 μg.mL ‑1) durante 24 h (Fig. 1A). Após terem sido inoculadas com P. cinnamomi durante 48 h, as amostras de fragmentos de raízes foram processadas para estudo em microscopia óptica (MO), microscopia de fluorescência (MF) (Pires et al., 2008) e para microscopia eletrónica de transmissão (MET) (Medeira et al., 2006a).B – As raízes de plântulas obtidas em cultura in vitro de meristemas, foram tratadas sobre agar, em placa de Petri (Fig. 1B), com deposição de INIA.indd   711 25/10/11   11:05:44712Agrorrural: Contributos Científicosgotas de solução de elicitina (100 μg.mL ‑1) na zona de absorção da raiz durante 24 h e, posteriormente, inoculadas durante 48 h e processadas para estudos microscópicos, seguindo a mesma metodologia referida no ponto 1.Fig. 1A Imersão das raízes de sobreiro em solução de elicitina.Fig. 1B Plântulas de sobreiro obtidas in vitro imediatamente antes da aplicação de elicitina.3. Resultados e DiscussãoOs efeitos das três elicitinas testadas foram semelhantes no sobreiro, quer em plantas obtidas de semente (seedlings), quer em plântulas obti‑das em cultura in vitro a partir de meristemas.A elicitina criptogeína impediu totalmente a invasão dos vasos floé‑micos e xilémicos na concentração de 500 μg.mL ‑1 e reduziu de 50% a invasão na concentração de 100 μg.mL ‑1, nas plantas de 4 meses, obti‑das de germinação de sementes (Figs. 2A e 2B). A elicitina capsiceína, quando aplicada na concentração de 500 μg.mL ‑1 nas raízes de plantas de 4 meses, obtidas da germinação de sementes impediu totalmente a colonização do cilindro vascular (Fig. 2C) (Maia et al., 2009).Fig. 2 Efeito das elicitinas: criptogeína-500 μg.mL-1 (A) e 100 μg.mL-1 (B), capsiceína-500 μg.mL-1 (C) na infeção dos cilindros vasculares de raízes de seedlings de sobreiro e respetivos controlos (inoculação sem pré-tratamento de elicitinas). Em ordenadas: cilindros vasculares infetados (%).INIA.indd   712 25/10/11   11:05:46713Ecofisica, recursos genéticos e melhoramento de plantasFig. 3 Efeito da elicitina cinamomina-500 μg.mL-1 na infeção dos cilindros vasculares (%) de raízes de seedlings de sobreiro e azinheira e respetivos controlos (inoculação sem pré-tratamento de elicitinas).A elicitina cinamomina aplicada a raízes de seedlings de sobreiro, im‑pediu a colonização dos vasos na concentração de 500 μg.mL ‑1 (Fig. 3A) (Maia et al., 2005; Medeira et al., 2007). O mesmo foi verificado na azinheira (Fig. 3B) (Medeira et al., 2006b; Medeira et al., 2007).Nas plântulas de sobreiro obtidas in vitro a elicitina cinamomina aplicada nas raízes na concentração de 100 μg.mL ‑1 bloqueou a coloni‑zação vascular (Fig. 4A). Nas plântulas de castanheiro obtidas in vitro a elicitina cinamomina na mesma concentração reduziu em 65% a coloni‑zação dos cilindros vasculares (Fig. 4B) (Medeira et al., 2010).Fig. 4 Efeito da elicitina cinamomina na concentração de 100 μg.mL-1 na infeção dos cilindros vasculares (%) de raízes de plântulas obtidas in vitro (A – sobreiro; B – castanheiro) e respetivos controlos (inoculação sem pré-tratamento de elicitina)Contrariamente nas plantas não tratadas e inoculadas verificámos que P. cinnamomi invadiu todo o córtex e o cilindro vascular, 48 h após a inoculação (Figs. 2 a 7).As observações microscópicas mostraram ainda que as três elici‑tinas testadas induziram no hospedeiro alterações estruturais, como a acumulação de materiais, que pelas características de coloração e auto‑fluorescência indiciam a presença de compostos fenólicos, nos espaços intercelulares do córtex da raiz onde as hifas de P. cinnamomi ficaram frequentemente sequestradas e em desorganização (Figs. 8 a10).A impregnação das paredes celulares pelo mesmo tipo de mate‑riais, bem como a sua deposição nos vacúolos das células do hospedeiro INIA.indd   713 25/10/11   11:05:47714Agrorrural: Contributos Científicosparecem constituir uma barreira física e também produzir um efeito tó‑xico que inviabiliza o agente patogénico e impede a progressão deste para o cilindro vascular (Medeira et al., 2010). A acumulação massiva de compostos fenólicos nos locais de tentativa de penetração das hifas pode ser considerada como uma resposta rápida e eficiente do hospedeiro, induzida pelas elicitinas (Benhamou et al., 2001).Fig. 8 (MET) Hifa de P. cinnamomi (P) em desorganização, num espaço intercelular rodeado por material osmiofílico (*).Figs. 9 e 10 (Microscopia de fluorescência) Acumulação de materiais que autofluorescem como fenóis nas paredes celulares e espaços intercelulares na área de entrada das hifas.As alteracões celulares que levaram à retenção de P. cinnamomi nos tecidos periféricos da raiz no sobreiro, azinheira e castanheiro são a ex‑pressão de reações de defesa induzidas pelas três elicitinas testadas, em presença do agente patogénico.4. ConclusõesObservou ‑se a indução de reações de defesa contra P. cinnamomi no sobreiro, azinheira e castanheiro quando se submeteram as raízes destas espécies a pré ‑tratamento com as elicitinas criptogeína, capsiceína e cina‑momina. A restrição da infeção aos tecidos corticais da raíz, onde o agente patogénico se desorganizou e não progrediu para os vasos, esteve associada Figs. 5 a 7 (MO) Colonização das raízes de sobreiro por P. cinnamomi (setas).Fig. 6 Invasão do córtex (*).Fig. 7 Colonização do cilindro vascular (seta).INIA.indd   714 25/10/11   11:05:47715Ecofisica, recursos genéticos e melhoramento de plantasa acumulação de materiais que se presume serem tóxicos, produzidos nas células dos hospedeiros em contacto com as hifas em desorganização.Os ensaios laboratoriais indicaram as elicitinas testadas como pro‑teinas muito eficientes no biocontrolo de P. cinnamomi. Será de grande importância desenvolver tecnologia no sentido de obtenção de elicitinas a baixo custo e de criar sistemas eficientes da sua dispersão nas plantas.AgradecimentosProjeto AGRO 416 – Impacto de Phytophthora cinnamomi associado ao stress hídrico no decline do sobreiro e azinheira. Novos métodos de deteção e controlo.Projeto PTDC/AGR ‑AAM/67628/2006 – Identificação, caracteri‑zação e papel de factores moleculares associados ao mecanismo de infe‑ção de espécies de Fagaceae por Phythophora cinnamomi.BibliografiaBenhamou, N.; Bélanger, R.R.; Rey, P.; Tirilly, Y. 2001. Oligandrin, the elicitin ‑like protein produced by the mycoparasite Pythium oligandrum, induces systemic resistance to Fusarium crown and root rot in tomato plants. Plant Physiology and Biochemistry 39: 681 ‑698.Brasier, C.M. 1992. Oak tree mortality in Iberia. Nature 360: 539.Grant, O.M.; Tronina, L.; Ramalho, J.C.; Besson, C.K.; Lobo ‑do ‑Vale, R.; Pereira, J.S.; Jones, H.G.; Chaves, M.M. 2010. Thermal imaging and chlorophyll fluo‑rescence indicate substantial summer stress in Quercus suber L. under current conditions, but a relatively minor impact of further reducing rainfall. Journal of Experimental Botany 61, 15: 4361 ‑4371.Hardham, A.R. 2005. Phytophthora cinnamomi. Pathogen profile. Molecular Plant Pathology 6: 589 ‑604.Horta, M.; Caetano, P.; Coelho, A.C.; Medeira, C.; Maia, I.; Neves, D.; Cravador, A. 2010. Virulence behaviour and gene expression patterns of a Phytophthora cinnamomi ß ‑cinnamomin silenced transformant. European Journal of Plant Pathology 127, 3: 427 ‑436.Lheirminier, J.; Benhamou, N.; Larrue, J.; Milat, M. ‑L.; Boudon ‑Padieu, E.; Nicole, M.; Blein, J. ‑P. 2003. Cytological characterization of elicitin ‑induced protec‑tion in tobacco plants infected by Phytophthora parasitica or phytoplasma. Phytopathology 93: 1308 ‑1319.Maia, I.; Medeira, C.; Dias, J.; Sousa, N.; Melo, E.; Moreira, A.; Cravador, A. 2005. The effect of the elicitin α ‑cinnamomin on the roots of cork ‑oak tree infected INIA.indd   715 25/10/11   11:05:47716Agrorrural: Contributos Científicosby Phytophthora cinnamomi. XL Reunião Anual da Sociedade Portuguesa de Microscopia Electrónica, Lisboa, Livro resumos, PB 02.Maia, I.; Diniz, I.; Melo, E.; Cravador, A.; Medeira, C. 2009. The elicitin capsicein induced defense responses in Quercus suber roots infected by Phytophthora cin‑namomi. Joint Meeting of the Spanish and Portuguese Microscopy Societies, 16 ‑19 July, Segovia, Abstracts book, pp. 141 ‑142.Medeira, M.C.; Maia, M.I.; Carvalho, M.T. 2006a. Flower bud failure in olive and the involvement of amoeboid protists. Journal of Horticultural Science and Biothecnology 81, 2: 251 ‑258.Medeira, C.; Maia, I.; Piassab, P.; Sousa, N.; Melo, E.; Moreira, A.; Cravador, A. 2006b. Phytophthora cinnamomi – Q. rotundifolia interaction and the effect of the elicitin α­‑cinnamomin. XLI Reunião Anual da Sociedade Portuguesa de Microscopia Electrónica, 14 ‑15 Dezembro, Braga, Livro resumos, pp. 68.Medeira, C.; Maia, I.; Sousa, N.; Cravador, A. 2007. Cinnamomin reduces the capa‑city of infection of cork oak and holm oak roots by P. cinnamomi. IUFRO Tree Biotechnology Congress 2007, 3 ‑8 June, Ponta Delgada, Açores, Abstract SII. 9.Medeira, C.; Maia, I.; Ribeiro, C.; Candeias, I.; Melo, E.; Sousa, N.; Cravador, A. 2010. Alpha cinnamomin elicit a defence response against Phytophthora cin‑namomi in Castanea sativa. 28th International Horticultural Congress, 22 ‑27 Agosto, Lisboa, Portugal, Livro resumos, Painel S06 275, pp. 321.Milat, M. ‑L.; Ducruet, J.M.; Ricci, P.; Marty, F.; Blein, J.P. 1991. Physiological and structural changes in tobacco leaves treated with cryptogein, a proteinaceous elicitor from Phytophthora cryptogea. Phytopathology 81: 1364 ‑1368.Mohamed, N.; Lheirminier, J.; Farmer, M. ‑J.; Fromentin, J.; Béno, N.; Houot, V.; Milat, M. ‑L.; Blein, J. ‑P. 2007. Defense responses in grape vine leaves against Botrytris cinerea induced by application of a Pythium oligandrum strain or its elicitin, oligandrin, to roots. Phytopatology 97: 611 ‑620.Moreira, A.C.; Martins, J.M. 2005. Influence of site factors on the impact of Phytophthora cinnamomi in cork oak stands in Portugal. Forest Pathology 35: 145 ‑162.Panabières, P.; Ponchet, M.; Allasia, V.; Cardin, L.; Ricci, P. 1997. Characterization of border species among Pythiaceae: several Pythium isolates produces elicitins, typical proteins from Phytophthora spp. Mycological Research 101: 1450 ‑1468.Piccard, K.; Ponchet, M.; Blein, J. ‑P.; Rey, P.; Tirilly, Y.; Benhamou, N. 2000. Oligandrin. A proteinaceous molecule produced by the mycoparasite Pythium oligandrum induces resistance to Phytophthora parasitica infection in tomato plants. Plant Physiology 124: 379 ‑395.Pires, N.; Maia, I.; Moreira, A.; Medeira, C. 2008. Early stages of infection of cork and holm oak trees by Phytophthora cinnamomi. In: Vázquez, J.; Pereira, H. (Eds.), Suberwood – New challenges. Universidad de Huelva, pp. 275 ‑282.Ricci, P.; Bonnet, P.; Huet, J.C.; Sallatin, M.; Beauvais ‑Caute, F.; Bruneteau, M.; Billard, V.; Michel, G.; Pernollet, J.C. 1989. Structure and activity of proteins from pathogenic fungi Phytophthora eliciting necrosis and acquired resistance in tobacco. European Journal of Biochemistry 183: 555 ‑563.Ricci, P. 1997. Induction of the hypersensitive response and systemic acquired re‑sistance by fungal proteins: The case of elicitins. In: Stacey, G.; Keen, T. (Eds.), Plant ‑microbe interactions. Chapman & Hall, New York, USA, pp. 53 ‑75.Sánchez, M.E.; Caetano, P.; Ferraz, J.; Trapero, A. 2002. Phytophthora disease of Quercus ilex in south ‑western Spain. Forest Pathology 32: 5 ‑18.INIA.indd   716 25/10/11   11:05:47

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