Este trabalho pertendeu contribuir para a análise funcional do gene QDRl da levedura Saccharomyces cerevisiae que codifica um presumível transportador da membrana plasmática. Este gene parece estar envolvido na resistência a múltiplas drogas, das quais se destacam a droga antimalária quinidina e os azóis, cetoconazole e fluconazole

Cabrita, Patrícia

Universidade do Algarve

  
 
 
Patrícia  Nunes
Área Eng. Alimentar
 EST/UAlg
 
 
Resistência a múltiplas drogas em 
Saccharomyces cerevisiae 
Resumo
Este trabalho pertendeu contribuir para a análise funcional 
do gene QDR1 da levedura Saccharomyces cerevisiae que 
codifica um presumível transportador da membrana 
plasmática. Este gene parece estar envolvido na resistência 
a múltiplas drogas, das quais se destacam a droga 
antimalária quinidina e os azóis, cetoconazole e 
fluconazole. 
INTRODUÇÃO 
A emergência, em diversos organismos, de estirpes 
resistentes a uma grande variedade de compostos 
citotóxicos, com estruturas não relacionadas e que actuam 
sobre diferentes alvos biológicos, tem constituido um 
obstáculo no tratamento de doenças infecciosas e de 
tumores. 
A manipulação de organismos patogénicos envolve algums 
riscos e, por isso, o fenómeno de resistência a múltiplas 
drogas (MDR) é muitas vezes examinado em modelos 
eucarióticos. 
O genoma de Saccharomyces cerevisiae encontra-se 
completamente sequenciado o que possibilitou a 
identificação de mecanismos biológicos comuns a todos os 
eucariontes, incluindo o Homem, em particular os 
mecanismos envolvidos no fenómeno MDR. 
A levedura possui sistemas de transporte activo 
dependentes da força protão-motriz pertencentes à 
Superfamília dos Facilitadores Maioritários (MFS) e prevê-
se a existência de cerca de 23 proteínas pertencentes a esta 
superfamília, envolvidas na resistência a múltiplas drogas. 
No entanto, a função fisiológica destas proteínas não foi 
ainda esclarecida sendo necessário estudar o seu papel na 
levedura. 
A sequência de nucleótidos do genoma de Saccharomyces 
cerevisiae ficou disponível na Internet a partir de 1996 e foi 
necessário realizar a análise funcional dos seus 6000 genes 
previsíveis. Na Europa surgiu o Projecto EUROFAN 
(“European Functional Analysis Network”) com o 
objectivo de realizar a análise funcional dos cerca de 4400 
genes cujo papel fisiológico era completamente 
desconhecido e que tinham escapado à abordagem clássica. 
Neste trabalho pretendeu-se realizar a análise funcional de 
um dos genes de de Saccharomyces cerevisiae, o gene  
QDR1, que revelou estar envolvido na resistência em 
levedura à droga antimalária quinidina e aos dois azóis 
fluconazole e cetoconazole. 
Análise funcional do gene QDR1 
que confere resistência a quinidina 
O gene QDR1, que codifica uma proteína pertencente à 
Superfamília de Facilitadores Maioritários envolvidos na 
resistência a múltiplas drogas (MFS-MDR), foi 
identificado como um determinante na resistência a 
cetoconazole e fluconazole, compostos que afectam a 
biossíntese de ergosterol presente na membrana plasmática, 
e à quinidina, droga antimalária e antiarrítmica. O 
crescimento da estirpe selvagem e da estirpe mutante no 
gene QDR1 em presença destes compostos apresentaram 
diferenças significativas, sendo o crescimento da estirpe 
selvagem menos afectada pela presenças destas drogas do 
que o crescimento da estirpe mutante de eliminação no 
gene QDR1. O gene de levedura em estudo foi denominado 
por QDR1 devido à resistência a quinidina.  
A quinidina é um agente antimalária usado no tratamento 
da malária, doença provocada pelo parasita Plasmodium 
falciparum, quando este organismo se revela resistente à 
droga antimalária cloroquina, frequentemente utilizada na 
sua eliminação. 
Curiosamente, nem a quinidina nem os dois azóis, 
cetoconazole e fluconazole, se encontram presentes no 
ambiente a que a levedura S. cerevisiae naturalmente se 
encontra exposta. Aliás, a quinidina exerce o seu efeito 
antimalária no parasita através de processos fisiológicos 
que não existem na levedura, sendo a concentração de 
droga usada nos nossos estudos muito superior à necessária 
para afectar as células de Plasmodium. No entanto, a 
verdade é que a eliminação do gene aumenta a 
susceptibilidade da levedura a quinidina quando esta é 
subitamente exposta à droga, prolongando o tempo 
necessário à sua adaptação à quinidina. Contudo, após esse 
período de adaptação, o nível de expressão do gene 
mostrou ser irrelevante para a resistência da célula à droga. 
A proteína Qdr1 foi localizada na membrana plasmática 
com base na observação microscópica da distribuição da 
fluorescência da proteína de fusão Qdr1-GFP 
superproduzida em células de levedura. A proteína de fusão 
foi construída a partir da fusão do gene QDR1 com o gene 
que codifica a proteína verde fluorescenete de Aequorea 
victoria.  
Visto que a proteína em estudo foi localizada na membrana 
plasmática e pertence à família MFS-MDR, esperava-se 
que esta funcionasse como exportador da(s) forma(s) 
protonada(s) de quinidina (esta droga antimalária é uma 
base fraca com dois locais de protonação). No entanto, não 
foi possível confirmar esta função. As células adaptadas  a 
quinidina do mutante nulo e do selvagem mostraram-se 
capazes de expulsar activamente a droga, marcada 
radioactivamente e pré-acumulada nessas células, após um 
pulso de glucose. Este fenómeno não foi detectado nas 
cálulas não adaptadas ao crescimento com quinidina e 
usadas como inóculo. Consistente com a indução deste(s) 
transportadores de quinidina em células do mutante e do 
selvagem, após adaptação à droga, não se detectou 
qualquer diferença na susceptibilidade dessas duas estirpes 
à quinidina, no caso das células terem sido previamente 
adaptadas por crescimento em presença da droga. É 
provável que esses exportadores de quinidina, 
presumivelmente induzidos pela droga, pertençam às 
superfamílias ABC ou MFS-MDR, sendo de referir que, 
anteriormente, foi identificado um outro transportador 
envolvido na resistência a quinidina. 
CONCLUSÕES 
O papel fisiológico desempenhado pelo gene QDR1 
continua por esclarecer. Não foi possível saber se a 
proteína Qdr1 é um transportador de compostos tóxicos ou 
se a sua capacidade para transportar múltiplas drogas é 
apenas fortuita. Esta proteína poderá desempenhar outros 
papeís dentro da célula como seja o de remover toxinas 
ambientais. 
A resistência a quinidina é mediada em levedura pela 
proteína Qdr1 e por um outro transportador também 
pertencente à família MFS-MDR. 
O estudo ao nível molecular e bioquímico do fenómeno de 
resistência a drogas em levedura tem por objectivo 
compreender os mecanismos de resistência a drogas em 
outros eucariontes mais complexos, incluindo o Homem. 
Estes estudos poderão contruibuir para desenvolver novas 
drogas mais eficazes no combate de doenças infecciosas, 
como são o caso da tuberculose e da malária cujo 
tratamento é dificultado pelo surgimento de estirpes de 
organismos resistentes às drogas utilizadas. 
REFERÊNCIAS 
Isabel Sá-Correia, Sandra Tenreiro, Patrícia Nunes, 
Cristina Viegas , Nuno Brôco e Paula Rosa (2000) 
Resistência a múltiplas drogas em Saccharomyces 
cerevisiae: uma abordagem pós-genómica. Boletim de 
Biotecnologia 67, 8-17. 
Nunes, P. A., Tenreiro, S.  and Sá-Correia, I. “Resistance 
and adaptation to quinidine in Saccharomyces cerevisiae: 
role of QDR1 gene (ORF YIL120w), encoding a plasma 
membrane transporter of the Major Facilitator Superfamily 
required for multidrug resistance.” Antimicrobial Agents 
and Chemotherapy 45(5), 1528-34. 


Resistência a múltiplas drogas em Saccharomyces cerevisiae

Sapientia (Univ. do Algarve)

    Patrícia  NunesÁrea Eng. Alimentar EST/UAlg  Resistência a múltiplas drogas em Saccharomyces cerevisiae ResumoEste trabalho pertendeu contribuir para a análise funcional do gene QDR1 da levedura Saccharomyces cerevisiae que codifica um presumível transportador da membrana plasmática. Este gene parece estar envolvido na resistência a múltiplas drogas, das quais se destacam a droga antimalária quinidina e os azóis, cetoconazole e fluconazole. INTRODUÇÃO A emergência, em diversos organismos, de estirpes resistentes a uma grande variedade de compostos citotóxicos, com estruturas não relacionadas e que actuam sobre diferentes alvos biológicos, tem constituido um obstáculo no tratamento de doenças infecciosas e de tumores. A manipulação de organismos patogénicos envolve algums riscos e, por isso, o fenómeno de resistência a múltiplas drogas (MDR) é muitas vezes examinado em modelos eucarióticos. O genoma de Saccharomyces cerevisiae encontra-se completamente sequenciado o que possibilitou a identificação de mecanismos biológicos comuns a todos os eucariontes, incluindo o Homem, em particular os mecanismos envolvidos no fenómeno MDR. A levedura possui sistemas de transporte activo dependentes da força protão-motriz pertencentes à Superfamília dos Facilitadores Maioritários (MFS) e prevê-se a existência de cerca de 23 proteínas pertencentes a esta superfamília, envolvidas na resistência a múltiplas drogas. No entanto, a função fisiológica destas proteínas não foi ainda esclarecida sendo necessário estudar o seu papel na levedura. A sequência de nucleótidos do genoma de Saccharomyces cerevisiae ficou disponível na Internet a partir de 1996 e foi necessário realizar a análise funcional dos seus 6000 genes previsíveis. Na Europa surgiu o Projecto EUROFAN (“European Functional Analysis Network”) com o objectivo de realizar a análise funcional dos cerca de 4400 genes cujo papel fisiológico era completamente desconhecido e que tinham escapado à abordagem clássica. Neste trabalho pretendeu-se realizar a análise funcional de um dos genes de de Saccharomyces cerevisiae, o gene  QDR1, que revelou estar envolvido na resistência em levedura à droga antimalária quinidina e aos dois azóis fluconazole e cetoconazole. Análise funcional do gene QDR1 que confere resistência a quinidina O gene QDR1, que codifica uma proteína pertencente à Superfamília de Facilitadores Maioritários envolvidos na resistência a múltiplas drogas (MFS-MDR), foi identificado como um determinante na resistência a cetoconazole e fluconazole, compostos que afectam a biossíntese de ergosterol presente na membrana plasmática, e à quinidina, droga antimalária e antiarrítmica. O crescimento da estirpe selvagem e da estirpe mutante no gene QDR1 em presença destes compostos apresentaram diferenças significativas, sendo o crescimento da estirpe selvagem menos afectada pela presenças destas drogas do que o crescimento da estirpe mutante de eliminação no gene QDR1. O gene de levedura em estudo foi denominado por QDR1 devido à resistência a quinidina.  A quinidina é um agente antimalária usado no tratamento da malária, doença provocada pelo parasita Plasmodium falciparum, quando este organismo se revela resistente à droga antimalária cloroquina, frequentemente utilizada na sua eliminação. Curiosamente, nem a quinidina nem os dois azóis, cetoconazole e fluconazole, se encontram presentes no ambiente a que a levedura S. cerevisiae naturalmente se encontra exposta. Aliás, a quinidina exerce o seu efeito antimalária no parasita através de processos fisiológicos que não existem na levedura, sendo a concentração de droga usada nos nossos estudos muito superior à necessária para afectar as células de Plasmodium. No entanto, a verdade é que a eliminação do gene aumenta a susceptibilidade da levedura a quinidina quando esta é subitamente exposta à droga, prolongando o tempo necessário à sua adaptação à quinidina. Contudo, após esse período de adaptação, o nível de expressão do gene mostrou ser irrelevante para a resistência da célula à droga. A proteína Qdr1 foi localizada na membrana plasmática com base na observação microscópica da distribuição da fluorescência da proteína de fusão Qdr1-GFP superproduzida em células de levedura. A proteína de fusão foi construída a partir da fusão do gene QDR1 com o gene que codifica a proteína verde fluorescenete de Aequorea victoria.  Visto que a proteína em estudo foi localizada na membrana plasmática e pertence à família MFS-MDR, esperava-se que esta funcionasse como exportador da(s) forma(s) protonada(s) de quinidina (esta droga antimalária é uma base fraca com dois locais de protonação). No entanto, não foi possível confirmar esta função. As células adaptadas  a quinidina do mutante nulo e do selvagem mostraram-se capazes de expulsar activamente a droga, marcada radioactivamente e pré-acumulada nessas células, após um pulso de glucose. Este fenómeno não foi detectado nas cálulas não adaptadas ao crescimento com quinidina e usadas como inóculo. Consistente com a indução deste(s) transportadores de quinidina em células do mutante e do selvagem, após adaptação à droga, não se detectou qualquer diferença na susceptibilidade dessas duas estirpes à quinidina, no caso das células terem sido previamente adaptadas por crescimento em presença da droga. É provável que esses exportadores de quinidina, presumivelmente induzidos pela droga, pertençam às superfamílias ABC ou MFS-MDR, sendo de referir que, anteriormente, foi identificado um outro transportador envolvido na resistência a quinidina. CONCLUSÕES O papel fisiológico desempenhado pelo gene QDR1 continua por esclarecer. Não foi possível saber se a proteína Qdr1 é um transportador de compostos tóxicos ou se a sua capacidade para transportar múltiplas drogas é apenas fortuita. Esta proteína poderá desempenhar outros papeís dentro da célula como seja o de remover toxinas ambientais. A resistência a quinidina é mediada em levedura pela proteína Qdr1 e por um outro transportador também pertencente à família MFS-MDR. O estudo ao nível molecular e bioquímico do fenómeno de resistência a drogas em levedura tem por objectivo compreender os mecanismos de resistência a drogas em outros eucariontes mais complexos, incluindo o Homem. Estes estudos poderão contruibuir para desenvolver novas drogas mais eficazes no combate de doenças infecciosas, como são o caso da tuberculose e da malária cujo tratamento é dificultado pelo surgimento de estirpes de organismos resistentes às drogas utilizadas. REFERÊNCIAS Isabel Sá-Correia, Sandra Tenreiro, Patrícia Nunes, Cristina Viegas , Nuno Brôco e Paula Rosa (2000) Resistência a múltiplas drogas em Saccharomyces cerevisiae: uma abordagem pós-genómica. Boletim de Biotecnologia 67, 8-17. Nunes, P. A., Tenreiro, S.  and Sá-Correia, I. “Resistance and adaptation to quinidine in Saccharomyces cerevisiae: role of QDR1 gene (ORF YIL120w), encoding a plasma membrane transporter of the Major Facilitator Superfamily required for multidrug resistance.” Antimicrobial Agents and Chemotherapy 45(5), 1528-34. 

https://sapientia.ualg.pt/bitstream/10400.1/185/1/12_31.pdf

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