Bakteriyel lakkaz yüksek sıcaklık ve pH’larda stabildir. Lakakz’ın birçok
biyoteknolojik ve endüstriyel uygulamaları vardır. Bu çalışmanın amacı lakkaz
pozitif yerel bir izolat olan Bacillus subtilis OH 67’nin lakkaz enzimini klonlamak,
eksprese etmek, saflaştırmak, boya giderici kapasitesi araştırmak ve karakterize
etmektir.
Lakkaz pozitif suş (Bacillus subtilis OH 67) İstanbul-Türkiye'den izole edilmiştir.
Bakteri DNA’sı PCR ve klonlama için kullanılmıştır. PCR ürünü (855bp), uygun
ekspresyon vektörüne (pET22 b) aktarıldıktan sonra konak hücresinde (E. coli
BL21 (DE3)) transforme edilmiştir. DNA kodlayan lakkaz gen dizisi birçok bakteri
türü ile karşılaştırılmış ve Bacillus subtilis ile %99 ve diğer bakteri türleri ile %87-
%99 arasında benzerlik göstermiştir.
Rekombinant lakkaz aktivitesi Guaiachol oksidasyonu ile araştırılmıştır. SDSPAGE
uygulaması sonucu enzimin moleküler ağırlığı 34 kDa olmuştur. Optimum
pH ve sıcaklık sırayla 6,6 ve 50°C olmuştur. Rekombinant lakkaz 40 °C ve 60 °C'de
%91 ve %90 aktivite göstermiştir. Enzimin Km ve Vmax değerleri 110,7721 μM
ve 19,3 μmol/min/mg olmuştur. Lakkazın boya giderim potansiyeli 16 farklı boya
üzerinde incelenmiştir. Bu çalışmanın sonuçları saflaştırılmış lakkazın CuSO4’ün
varlığında endüstriyel ve kimyasal boyaların gideriminde güçlü bir şekilde etkili
olduğunu göstermiştir. Lakkaz aktivitesi FeSO4 (5mM) 'ın ilavesiyle artmıştır.
Rekombinant lakkaz 1mM’lık EDTA, MgCl2, CuCl2, NiCl2, MnCl2, CaCl2 ve
ZnCl2 tarafından orta derecede inhibe edilmiştir. Ayrıca 5 mM konsantrasyondaki
SDS, HgCl2, üre, 2-merkaptoetanol, Tween-80 lakkaz aktivitesini %50’nin altına
düşürmüştür.
Bu çalışmadan elde edilen sonuçlara göre E. coli'de rekombinant lakkaz
enzimin üretimi endüstriyel ve biyoteknolojik uygulamalar için umut verici bir aday
olduğunu ortaya koymuştur. Enzim yüksek sıcaklıklarda aktivitesini korumuştur.
Sonuç olarak, enzim modifikasyona değer ve gelecekte endüstrinin farklı
alanlarında kullanılabilir.Bacterial laccases are very stable at high temperature and pH values. Laccase has
many biotechnological and industrial applications. This research was aimed to
clone, express, purify, characterize, and decolorization activity of the laccase from
a local isolate Bacillus subtilis OH 67.
The laccase positive strain (Bacillus subtilis OH 67) was isolated from Istanbul-
Turkey. PCR product (Laccase gene) was transformed to E. coli BL21 (DE3) after
ligation to pET22b vector. DNA sequence of laccase gene has a 99% similarity with
Bacillus subtilis, but the other strains identity was among 87%-99%.
The molecular weight of recombinant laccase was assigned as 34 kDa. Optimum
pH and temperature of recombinant laccase was 6,6 and 50oC. Recombinant
laccase exhibited 91% and 90% activity at 40°C and 60°C. The Km and Vmax
values of the enzyme were obtained as 110,7721 μM and 19,3 μmol/min/mg. The
recombinant laccase strongly decolorized 16 types of industrial and chemical dyes.
Laccase activity was increased by addition of FeSo4 (5mM). Recombinant laccase
was moderately inhibited by EDTA, MgCl2, CuCl2, NiCl2, MnCl2, CaCl2, and
ZnCl2. Moreover, the recombinant laccase activity was found to be less than 50%
in the presence of SDS, HgCl2, Urea, 2-Mercaptoethanol, Tween-80 at a
concentration of 5mM.
In conclusion, the production of recombinant laccase enzyme in E. coli proved to
be a promising candidate for industrial and biotechnological applications. The
enzyme maintained its activity at high temperatures. As a result, the enzyme is
worthy of modification and can be used in different area of industry in the future.Bu tez çalışması pamukkale üniversitesi bilimsel araştırma projeleri tarafından 2016FEBE043 nolu proje ile desteklenmiştir
