Človeške embrionalne matične celice (EMC) so pluripotentne celice, ki imajo sposobnost samoobnavljanja in diferenciacije v katerikoli celico odraslega človeškega telesa. Embrionalne matične celice lahko uporabljamo na področju farmacevtskih raziskav, celičnih terapij in presaditev tkiv in organov. Najpogosteje jih pridobivamo z izolacijo iz notranjega celičnega skupka blastociste embrijev, pridobljenih s postopkom oploditve in vitro. Leta 2006 sta Takahashi and Yamanaka uspešno reprogramirala somatske celice v pluripotentne matične celice z uporabo genov za transkripcijske dejavnike Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc, ki se močno izražajo v pluripotentnih EMC. Za gojenje EMC v in vitro kulturi so sprva uporabljali hranilne plasti mišjih embrionalnih fibroblastov (MEF) in gojišče z dodanimi rasnimi dejavniki in govejim serumom. Ta standardni protokol vsebuje veliko živalskih produktov, ki lahko vsebujejo imunogene in bi pri klinični uporabi predstavljali nevarnost za reakcijo z imunskim sistemom prejemnika. Razvoj gre v smeri uporabe pogojev brez hranilnih plasti in gojišč brez seruma. Večinoma se uporabljajo ekstracelularni matriksi, kot so Matrigel, kolagen IV, laminin, fibronektin in gojišča s humanim serumom ali njegovimi nadomestki. Embrionalne in inducirane pluripotentne matične celice lahko med in vitro kulturo pridobijo kromosomske nepravilnosti, ki jim omogočajo selektivno prednost in s tem razrast v celični kulturi. Najpogostejše kariotipske spremembe vključujejo pridobitve na kromosomih 1, 12, 17, 20 in X. Te mutacije so lahko posledica anafaznega zaostajanja, kromosomskega nerazdvajanja in poškodb DNA. Spits in sodelavci (2008) so prvi poročali o deleciji na dolgem kraku kromosoma 18. Delecija se je v celicah pojavila skupaj z duplikacijo na kromosomu 5q ali 7q. Kot posledica nepravilne poprave je nastal derivativni kromosom 18, ki je vseboval del kromosoma 18 in del kromosoma 5 ali 7. Na lokusu 18q je prisotnih veliko tumor-supresorskih genov, kot so SMAD4, SMAD2 in DCC. V tej magistrski nalogi smo spremljali človeške EMC z delecijo 18q v kulturi in med diferenciacijo. Najprej smo želeli poiskati označevalec, ki bi omogočil razlikovanje med celicami mutanta in divjega tipa. Naš cilj je bil raziskati, ali nediferencirane celice z delecijo 18q, ki so gojene na Lamininu-521, pridobijo selektivno prednost, kot se to zgodi v kokulturi z MEF. Zanimale so nas tudi lastnosti mozaičnih kultur med spontano in usmerjeno diferenciacijo v hepatoblast. Mozaične kulture smo ustvarili z mešanjem različnih deležev celic divjega tipa (DT) in mutanta (MT) (10 % MT z 90 % DT in 50 % MT z 50 % DT). Za razlikovanje med celicami DT in MT smo uporabili metodo verižne reakcije s polimerazo v realnem času, s testom za določanje variabilnega števila kopij genov ATP9B in NFATC1 in testom za ugotavljanje stopnje izražanja gena LINC00116. Na nivoju proteinov smo uporabili protitelesa proti citoplazemskemu proteinu TSPYL5, ki smo jih zaznavali z imunofluorescenčno mikroskopijo, avtomatskim celičnim števcem in pretočnim citometrom. Preverili smo občutljivost testov in njihovo zmožnost zaznavanja celic mutanta v mozaičnih kulturah. Pripravili smo mešanice DNA in RNA z različnim deležem DT in MT. Rezultati so pokazali, da lahko spremembo v številu kopij in izražanju gena zanesljivo zaznamo v primeru, da je razlika v vsebnosti mutanta vsaj 20 %. Mozaične kulture nediferenciranih celic smo vzdrževali v in vitro pogojih 13 pasaž, med katerimi smo izmenično določali izražanje in število kopij genov. Količina mutanta je med posameznimi pasažami nihala, vendar pa v nobenem primeru ni prišlo do razrasta mutanta v kulturi. Najbolj se je prevzetju približala kultura s 50 % začetno vsebnostjo mutanta celične linije VUB04_CF, saj je količina mutanta narasla v prvih treh pasažah in ostala precej konstantna do konca poskusa. Dokazali smo tudi, da je pritrjevanje celic na laminin enako učinkovito tako pri divjem tipu kot pri mutantu in da se razmerje med njima ne spreminja na podlagi tega dejavnika. Po odvzemu dejavnika, ki vzdržuje pluripotentnost celic, začnejo EMC spontano diferencirati, kar vpliva na signalne poti in celični cikel. Drugačen profil izražanja genov celic z delecijo 18q lahko privede do prednosti pred divjim tipom v procesu specializacije celic. Spremembe v našem eksperimentu so se pokazale tako na fenotipu kot na znižanju števila kopij in znižanju izražanja gena ter s tem dokazale selektivno prednost mutanta. Enako smo pričakovali tudi pri diferenciaciji celic v hepatoblast, saj so izpostavljene stresnim dejavnikom med diferenciacijo v specifičen tip celic. Izkazalo se je, da celice z mutacijo na kromosomu 18 ne pridobijo prednosti v kulturi med usmerjeno diferenciacijo v hepatoblast. Na nivoju proteinov smo želeli razliko med divjim tipom in mutantom pokazati z uporabo protitelesa proti proteinu TSPYL5. Z barvanjem jeder z barvilom Hoechst in analizo s pretočnim citometrom smo uspeli pokazati spremembe v celičnem ciklu med diferenciacijo, medtem ko je bilo razlikovanje med divjim tipom in mutantom neuspešno, saj se je protitelo vezalo tako v citoplazmi divjega tipa kot mutanta pred in po diferenciaciji. Po podatkih iz literature je meja zaznave mozaicizma z metodo qPCR med 5 % in 10 %. Z našimi testi za število kopij in izražanje gena smo razliko med MT in DT zaznali pri spremembi količine MT za 20 %, kar je bilo za naše eksperimente sprejemljivo. Mešanice enakih deležev MT in DT so ustvarile enake pogoje za preučevanje selektivne prednosti, medtem ko so mešanice z 10 % MT služile kot realistični primeri naravnega mozaicizma, pri katerih bi lahko zaznali prevzem kulture. Po predhodnih podatkih so celice z delecijo 18q prevzele kulturo v prvih nekaj pasažah, v primeru gojenja celic na hranilni plasti MEF, medtem ko v kulturi na Lamininu-521 razrasta mutanta nismo opazili. Razlog je lahko v uporabi različnih tehnik disociacije pri pasažah. Za sproščanje celic z laminina smo uporabili encime in tako pridobili suspenzijo celotne populacije celic v gojilni posodi, vključno s poškodovanimi in senscentnimi celicami. Kolonije v kulturi na hranilni plasti pa je izbral operator, jih mehansko razrezal na majhne kose in jih prenesel v novo gojilno posodo. Pri tej tehniki obstaja večja možnost pristranskosti pri izbiri kolonij, ki lahko vpliva na količino mutanta v novi pasaži. Pri spontani diferenciaciji preživi več celic z delecijo 18q kot celic divjega tipa. Na kromosomu 18q se nahajajo številni tumor-supresorski geni, kar lahko pojasni selektivno prednost celic z delecijo. Proces diferenciacije in manj tumor-supresorskih genov v mutantu bi lahko sprožili maligno transformacijo. Med usmerjeno diferenciacijo so celice izpostavljene večjemu selekcijskemu pritisku, saj dodani faktorji, ki sprožijo diferenciacijo, vplivajo na spremembe v signalnih poteh. Čeprav smo pričakovali, da bodo rezultati podobni kot pri spontani diferenciaciji, je razmerje med divjim tipom in mutantom ostalo enako, kar je možno pojasniti s tem, da spremembe v bioloških procesih med usmerjeno diferenciacijo v hepatoblast ne vplivajo na celice z delecijo 18q in njihov molekulski profil ni pomemben za razvoj endoderma.
Glede na rezultate analize izražanja gena TSPYL5 smo pričakovali, da bo protein, ki ga gen kodira, ustrezen označevalec celic z delecijo 18q, vendar se je izkazal kot neuspešen. Številni dejavniki, kot so posttranskripcija, translacija in hitrost razgrajevanja proteina, vplivajo na povezavo med RNA in proteini ter lahko povzročajo razlike v izražanju. S to raziskavo smo dobili vpogled v lastnosti EMC z delecijo 18q, vendar so za potrditev rezultatov in za boljšo statistično značilnost potrebni dodatni poskusi z več biološkimi ponovitvami.Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent cells that possess properties of self-renewal and the capacity to differentiate into any cell type of the adult human body. Embryonic stem cells are valuable for their use in pharmaceutical research, cell therapies and transplantation procedures. However, when hESCs are kept in in vitro culture, they tend to acquire chromosomal abnormalities, which, in case they provide the hESCs with a selective advantage, can cause aberrant cells that can take over the culture. One of the reported abnormalities that confer a selective advantage to cells when co-cultured with mouse embryonic fibroblasts (MEFs), is a derivative chromosome 18. In this thesis we focused on progression of the 18q deletion during undifferentiated hESCs culture and upon their differentiation, when cultured on a more clinically-relevant feeder-free cell culture system based on Laminin-152.
Mosaic cultures were created by mixing different ratios of wild-type (WT) and mutant (MT) cells (10% of MT and 90% of WT, 50% of MT and 50% of WT). Real time polymerase chain reactions, with copy number assays for genes ATP9B and NFATC1 and gene expression assays for LINC00116 were used to discriminate between wild-type and mutant cells in mixes. At the protein level, antibodies against cytoplasmic protein TSPYL5 were used. They were detected with immunofluorescent microscopy, an automated cell counter and flow cytometry.
Genes ATP9B, NFATC1 and LINC00116 are suitable genomic markers for cells carrying the 18q deletion, but protein marker TSPYL5 failed to distinguish between the WT and MT cells. In the culture of undifferentiated hESCs, we observed fluctuations in ratios of MT vs WT cells. However, partial take-over was only observed in the culture containing 50% MT of one cell line, while in all other combinations there was no significant increase observed between passages. In contrast to spontaneous differentiation, where cells with 18q deletion seem to display a selective advantage upon directed hepatoblast differentiation, the ratios of WT and MT cells remained similar. Further research should be carried out to confirm and validate our results
