Bakteri merupakan mikroorganisme yang dapat memproduksi metabolit sekunder, salah satunya antibiotik. Isolat KP13 adalah bakteri yang diisolasi dari rizosfer tanaman Kayu Putih. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antibiotik fraksi teraktif isolat KP13 terhadap bakteri Escherichia coli dan kemampuan menyebabkan kebocoran pada sel bakteri Escherichia coli. Ekstraksi antibiotik menggunakan pelarut etil asetat dan dilakukan fraksinasi dengan gradien pelarut n-heksan-etilasetat dan pelarut metanol. Hasil fraksinasi dilakukan KLT untuk mengelompokkan kelompok fraksi berdasarkan nilai Rf nya. Kelompok fraksi dibandingkan aktivitas antibiotiknya dilanjutkan pengujian Kadar Hambat Minimum (KHM). Spekrofotometri UV digunakan untuk menguji kebocoran substansi sel bakteri meliputi asam nukleat dan protein serta Spektrofotometri Serapan Atom (SSA) untuk menguji pengluaran kadar ion K+ dan Ca2+. Hasil menunjukkan fraksi teraktif dalam menghambat pertumbuhan bakteri Escherichia coli adalah fraksi nomor 1 dengan nilai kadar hambat minimal (KHM) 5% dan dengan diameter zona hambat 7,33±0,58 mm
