Transient Receptor Potential (TRP; C-classical; TRPC) Kanäle sind Ionenkanäle in der Plasmamembran und erlauben einen nicht selektiven Ca2+-Einstrom in die Zelle. Durch die Stimulation von Gq-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GqPCRs) wird dieser Ca2+-Einstrom erhöht, wodurch über Calmodulin, die Phosphatase Calcineurin aktiviert wird. Der Transkriptionsfaktor nuclear factor of activated T-cells (NFAT) wird durch Calcineurin dephosphoryliert und wandert in den Nucleus, wo er mit anderen Transkriptionsfaktoren interagiert und Hypertrophie-induzierende Gene aktiviert. TRPC3 ist hierbei eine der relevantesten Isoformen für die Entwicklung einer Myokardhypertrophie, wie sie im Rahmen zahlreicher kardiovaskulärer Erkrankungen zu finden ist. Eine kardiale Hypertrophie ist an der Pathogenese der Herzinsuffizienz beteiligt und stellt somit einen wichtigen Risikofaktor für den plötzlichen Herztod dar. Aus diesem Grund ist es von besonderer Bedeutung die Regulation von TRPC3 Kanälen und deren Einfluss auf hypertrophe Prozesse genauer zu untersuchen.
In Vorversuchen wurde FK506 bindendes Protein 52 (FKBP52) als neuer Interaktionspartner von TRPC3 im Herzen gefunden. Die dabei gefundene FKBP52-Bindestelle von TRPC3 lag erstaunlicherweise außerhalb der zu erwartenden Bindestelle mit den vermeintlichen FKBP Bindemotiven.
FKBP52 ist ein Immunophilin, das als cis/trans Isomerase fungiert und dadurch an der Regulation von verschiedenen Ionenkanälen beteiligt ist, darunter auch TRPC-Kanäle. Es zeigte sich, dass alle Domänen von FKBP52, bis auf die TPR3-Domäne und der C Terminus, in der Lage waren, mit TRPC3 zu interagieren. Aufgrund der Funktion der FKBPs und der Tatsache, dass TRPC3 eine Rolle in der Entwicklung einer kardialen Hypertrophie spielt, sollte in dieser Arbeit untersucht werden, ob FKBP52 die Aktivität und die nachgeschalteten hypertrophen Signalwege von TRPC3 beeinflusst.
Die Downregulation von FKBP52 führte zu einer verstärkten TRPC3-abhängigen hypertrophen Antwort in neonatalen Rattenkardiomyozyten (engl. neonatal rat cardiomyocytes, NRCs). Der gleiche Effekt war sowohl in NRCs und in adulten Rattenkardiomyozyten (engl. adult rat cardiomyocytes, ARCs) zu sehen, wenn Peptidyl-Prolyl-cis-trans-Isomerase (PPIase) defiziente Mutanten von FKBP52 überexprimiert wurde. Verkürzte FKBP52 Mutanten erhöhten ebenfalls die TRPC3-abhängige Aktivität von Calcineurin, was durch eine verstärkte Translokation von NFAT in den Nucleus von NRCs zu sehen war. Außerdem konnte in NRCs und in menschlichen embryonalen Nierenzellen (engl. human embryonic kidney cells, HEK 293 Zellen), die die PPIase defizienten Mutanten exprimierten, ein erhöhter Ca2+-Einstrom in die Zelle beobachtet werden. Das gleiche war nach Downregulation von FKBP52 in HEK 293 Zellen, die TRPC3 überexprimieren (T3.9 Zellen), zu sehen. Eine funktionelle Interaktion von FKBP52 und TRPC3 konnte auch in elektrophysiologischen Messungen bestätigt werden. Nach der Interaktion von TRPC3 mit den FKBP52 Mutanten zeigte sich eine erhöhte TRPC3-Aktivität.
Die Daten zeigen somit, dass TRPC3-Kanäle durch FKBP52 reguliert werden und diese Regulation abhängig von der PPIase Funktion ist. Eine Interaktion von TRPC3 mit vollfunktionsfähigem FKBP52 könnte vor einer Ca2+-Überlastung und einer damit einhergehenden pathologischen Hypertrophie des Herzens schützen.Transient Receptor Potential (TRP; C-classical; TRPC) channels are ion channels in the plasma membrane which allow a non-selective Ca2+ influx into the cell. Stimulation of Gq-protein-coupled receptors (GqPCRs) increases the Ca2+ influx and activates the phosphatase calcineurin via calmodulin. Afterwards the transcription factor nuclear factor of activated T-cells (NFAT) is dephosphorylated by calcineurin and translocates to the nucleus, where it interacts with other transcription factors and activates hypertrophy-associated genes. TRPC3 is one of the most relevant isoforms of TRPC channels in the maladaptive hypertrophic program during chronic cardiac diseases. Hypertrophy can lead to the development of heart failure and is therefore an important risk factor for cardiac death. For this reason it is important to understand the regulation of TRPC3 channels in the heart and the influence of TRPC3 in hypertrophy.
Preliminary experiments revealed FK506 binding protein 52 (FKBP52) as a novel interaction partner of TRPC3 in the heart. Surprisingly, the FKBP52 binding domain of TRPC3 was beyond the expected binding domain with the putative FKBP binding motifs. FKBP52 is an immunophilin which functions as cis/trans isomerase and is involved in the regulation of various ion channels, including TRPC channels. We demonstrated that all domains of FKBP52, except the TPR3 domain and the C-terminal region, interact with TRPC3. Due to the function of FKBPs and the fact that TRPC3 is important in development of cardiac hypertrophy, the aim of this work was to examine whether FKBP52 influences the activity and downstream hypertrophic signalling pathways of TRPC3.
Downregulation of FKBP52 promoted an enhanced TRPC3-dependent hypertrophic response in neonatal rat cardiomyocytes (NRCs). The same effect could be seen by overexpression of peptidyl-prolyl-cis-trans-isomerase (PPIase) mutants of FKBP52 in NRCs and adult rat cardiomyocytes (ARCs). Additionally, the PPIase-deficient FKBP52 mutants increased the TRPC3-dependent activity of calcineurin, which was observed by enhanced translocation of NFAT into the nucleus of NRCs. We detected that the expression of the PPIase-deficient FKBP52 mutants in NRCs and human embryonic kidney cells (HEK 293 cells) increased the Ca2+ influx to the cells. A similar effect could be seen after downregulation of FKBP52 in HEK 293 cells overexpressing TRPC3 (T3.9 cells). A functional interaction of FKBP52 and TRPC3 was also confirmed in electrophysiological measurements. The interaction of TRPC3 with the FKBP52 mutants promoted an increased TRPC3 activity.
The data demonstrate that TRPC3 channels are regulated by FKBP52 and that this regulation depends on the PPIase function. An interaction of TRPC3 with functional FKBP52 could protect against Ca2+ overload and Ca2+-associated pathological hypertrophy of the heart
