Los capítulos 3 y 4 están sujetos a confidencialidad por el autor.
69 p.La protección del genoma viral durante el viaje extracelular es un requisito absoluto para la supervivencia y replicación del virus. Una vez que la partícula viral se une a la célula huésped, puede comenzar la eyección del material genómico. Además de las cápsides proteicas casi universales, ciertos virus poseen una capa de membrana que encierra su genoma de ADN bicatenario (ds) dentro de la cubierta proteica. Aunque las propiedades mecánicas de otros virus se han estudiado anteriormente, esta tesis investiga un virus con una membrana bajo su cápside proteica. Usando el virus enterobacterial PRD1 como prototipo de virus sin cola que contienen membrana, y una combinación de ensayos de nanoindentación mediante la microscopía de fuerza atómica y modelado de elementos finitos, mostramos que la arquitectura jerárquica de PRD1 (cubierta de proteína, vesícula proteolipidica, ds ADN) proporciona una mayor estabilidad contra el estrés mecánico que la lograda por otros virus icosaédricos ds ADN que carecen de una membrana. La combinación de un caparazón proteínico rígido y quebradizo junto con una vesícula de membrana blanda y dócil produce un nanomaterial compuesto resistente adecuado para proteger el ADN viral durante el transporte extracelular. Además, observamos la estructura y las propiedades mecánicas que implican el ensamblaje del tubo de eyección de ADN de dicho virus. Si bien los estudios han resuelto la estructura de varios virus en tubos, aquí investigamos un fago que forma el tubo de eyección de ADN al unirse. Empleamos la reconstrucción con crio-microscopía electrónica (cryo-EM) para mostrar que esta partícula viral está produciendo un tubo estructurado, no helicoidal, con una simetría axial de siete veces, que se forma utilizando la membrana proteolípica. En combinación con ensayos de nanoindentación de microscopía de fuerza atómica (AFM), visualizamos partículas individuales que producen tubos y mostramos que el tubo de PRD1 tiene una rigidez comparable a estructuras tubulares similares, como túbulos lipídicos gruesos o virus del mosaico del tabaco (TMV). Hay sugerencias sobre la capacidad del tubo de autocurarse, cuando se libera presión mecánica externa después de la compresión más allá del punto de fluencia. Estos resultados proporcionan la primera comprensión de la relación entre la estructura, las propiedades mecánicas y la función de los virus que contienen membrana. Podrían beneficiar a los nanoingenieros que podrían incorporar el diseño compuesto de PRD1 en su búsqueda de nanopartículas más estables, pero también la búsqueda de nuevas soluciones farmacéuticas que se ocupen de la resistencia antibacteriana y las infecciones bacterianas en general, ya que este nanotubo proteolipídico puede perforar agujeros en la pared celular bacteriana.El trabajo presentado en esta tesis implica el bacteriófago sin tubo PRD1, un virus con una membrana lipídica debajo de su capa proteica. Aquí se abordan cuestiones relacionadas con la estabilidad mecánica de la partícula, junto con las contribuciones de cada uno de sus componentes arquitectónicos. También arrojamos luz sobre el ensamblaje, la estructura y las características del tubo de eyección de ADN proteolipídico; esta información sin precedentes podría proporcionar nuevas estrategias sobre el diseño de nuevos antimicrobianos y nanopartículas.Esta tesis tiene los siguientes objetivos generales:¿ La investigación mecánica mediante microscopía de fuerza atómica (AFM) del bacteriófago PRD1 que contiene lípidos mediante el análisis de cada componente arquitectónico utilizando partículas derivadas de PRD1.¿ La investigación mecánica y estructural del tubo de eyección de ADN de PRD1, utilizado para la infección de células bacterianas, mediante microscopía crioelectrónica (cryo- EM) y AFM.La tesis se estructura de la siguiente manera:El Capítulo 1 es el capítulo introductorio y cubre una descripción general de virus y bacteriófagos, con un enfoque específico en PRD1; así como una descripción general de las dos principales técnicas utilizadas durante el lapso de la tesis: AFM y cryo-EM.El Capítulo 2 cubre los objetivos de este estudio. El Capítulo 3 describe la investigación nanomecánica de los componentes arquitectónicos individuales de PRD1, y dilucida cómo estos contribuyen a la rigidez y la estabilidad mecánica del virión PRD1.El Capítulo 4 estudia la investigación estructural y nanomecánica del tubo de eyección de la cola de PRD1. El Capítulo 5 es el capítulo final que fusiona las principales conclusiones de cada capítulo y brinda una breve perspectiva de lo que esta investigación puede proporcionar a los futuros investigadores.El Capítulo 6 contiene la bibliografía para la tesis completa.El apéndice tiene una lista de todas las abreviaturas presentes en este trabajo, así como una colección de artículos publicados del trabajo que se han realizado en los últimos 4 años.CONCLUSIONES¿ Los virus se pueden ver como entidades biológicas compuestas donde los ácidos nucleicos, las proteínas y los lípidos se ensamblan para producir partículas funcionales para la infección. Esta tesis ha proporcionado una primera comprensión de las propiedades nanomecánicas de los virus con una membrana interna. Se puede esperar que se convierta en una referencia para el trabajo futuro con esta clase de virus.¿ Las propiedades nanomecánicas de PRD1 muestran que el genoma presurizado proporciona rigidez, pero no mejora la estabilidad, ya que los mutantes sin genoma ceden bajo la misma fuerza, incluso si son menos rígidos.¿ Las cápsidas de proteínas Penton-less rinden 3 veces antes que los mutantes libres de genoma, pero que contienen vesículas.¿ La vesícula proteolípica es de un orden de magnitud menos rígida que cualquier partícula PRD1 investigada, pero se comporta de manera similar a otras vesículas lipídicas.¿ Proponemos que, como en un material sándwich compuesto, una matriz proteínica / polipéptido interfacial en PRD1 genera una conexión estrecha que acopla mecánicamente la cápside y la membrana. Será interesante ver si el principio de diseño de mejorar la estabilidad mecánica mediante la formación de una doble capa compuesta de cápside-membrana es exclusivo de PRD1 o generalmente empleado para esta clase de virus.¿ El tubo de eyección de ADN de PRD1 está compuesto de material proteolípido. La polimerización de la proteína formadora de tubos conduce a una serie de discos apilados, cada uno compuesto de siete subunidades, y que tiene una simetría de siete veces, pero no una helicoidal.¿ Estudios previos de mutación del fago PRD1, junto con nuestros resultados actuales, sugieren que la proteína transmembrana P32 es la proteína polimerizante.¿ Este enriquecimiento de proteínas durante la remodelación de la membrana conduce a una bicapa de lípidos más delgada y colapsada durante la polimerización del tubo.¿ Las características nanomecánicas del tubo, además de la presencia de una estructura definida, insinúan la presencia de material proteico, ya que exhibe un carácter más rígido en comparación con la vesícula lipídica sola.PERSPECTIVASCuando respondimos algunas preguntas sobre la estructura mecánica y el ensamblaje de la cápside y el tubo de PRD1, también surgen preguntas adicionales.1. Se debe realizar un trabajo final sobre la estructura del tubo.2. Queda por validar si otros virus que contienen membrana muestran un comportamiento similar al que muestra PRD1. Esto podría generalizar nuestro modelo propuesto de que la arquitectura multicapa proporciona una mayor estabilidad de partículas.3. La investigación de mutante P32, que producen tubos más cortos proporcionaría una mayor comprensión en el montaje del nanotubo.En una perspectiva amplia, nuestros resultados pueden ayudar a los nanoingenieros en su búsqueda de nanopartículas más estables, ya que la naturaleza compuesta de PRD1 puede ser una inspiración para el diseño de nanopartículas. Además, la búsqueda de nuevos antimicrobianos podría ser asistida por el uso de máquinas de nanodrilling, como el tubo de eyección del bacteriófago PRD1.CICbioGUNE
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